淫羊藿中淫羊藿苷的高效液相色谱法测定含量

贾学忠

淫羊藿富含黄酮类化合物，可增加脑血流量，具有促造血功能、强化免疫及骨代谢和抗衰老等功效。淫羊藿苷为淫羊藿主要药理成分，是一类黄酮类化合物，在人体内分布极广，并可通过血脑屏障。近年相关药理研究多集中于该物质在心血管系统、神经系统以及骨组织与泌尿生殖系统的作用机制等方面。现已明确的是其对免疫系统有明显调节作用，抗肿瘤作用等。我院将该药物应用于临床，主要发挥其补肾阳、强筋骨的作用，研究方向以其成药制剂治疗男女不孕不育为主[1]。为控制制剂中有效成分含量，进一步把握和提升药品质量，笔者以高效液相色谱法测定制剂中淫羊藿苷含量。现总结并报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国Agilent 1100 高效液相色谱系统（含自动脱气机、VWD检测器）。

1.2 试药

供含量测定的淫羊藿苷对照品（陕西帕尼尔生物科技有限公司生产，10 ml/包，批号0747-201511），本院淫羊藿苷制剂，色谱纯为乙腈（美国Tedia公司），水选取注射用水，分析纯等。

2 方法

2.1 理化鉴定[2]

检查黄酮类，准确称量药物粉末0.1 g，加水10 ml，水浴10 min，滤过蒸干，加乙醇5 ml并热溶，再次滤过。滤液中加镁粉及浓盐酸，显红色。准确称量药物粉末0.5 g入甲醇10 ml，水浴温浸30 min后滤过。滤液浓缩至1 ml留备供试品溶液。取淫羊藿苷对照品，甲醇溶解，制备l～2 mg/1 ml对照溶液。取2种溶液各10 μl，点于同一硅胶H薄层板，以10：1：1：1配比的醋酸乙酯—丁酮—85%甲酸—水展开，展距为15 cm。取出晾干，置于紫外分析灯（365 nm）下观察，供试品与对照品在色谱相应位置上呈现相同暗红斑点。1%AlCl3试液喷雾再次观察，斑点呈现橙色。

2.2 含量测定

色谱条件：色谱柱ZorbaxSB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈—水（25：75，V/V），流速设定：1.0 ml/min；检测波长的确立：取淫羊藿苷对照品适量，加50%乙醇溶液溶解，稀释至1 mg/ml，50%乙醇溶液作为空白对照，于200～400 nm波长范围中扫描，波长达270 nm时出现最大吸收[3]。计算理论塔板数≥2 500。准确称量对照品制备对照溶液，经甲醇溶液溶解制备1 ml溶液，含淫羊藿苷34.5 μg。准确称取供试品0.2 g，研细置于锥形瓶（有塞）中，入50%乙醇溶液20 ml，经功率200 W，频率59 KHz超声处理45 min，放置至室温后称重，不足则以50%乙醇溶液补足。摇匀过滤后精密量取4 ml水浴蒸干，加水（10 ml）溶解，以乙酸乙脂10 ml萃取3次，减压回收溶剂至干，以50%乙醇溶液溶解残渣，定容至25 ml，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 制备标准曲线

准确称量淫羊藿苷对照品10.40 mg，置于50 ml量瓶中，用50%乙醇溶液溶解稀释成浓度为208.0 μg/ml的对照品储备液。分别从中准确抽取 0.6 ml、1.2 ml、1.8 ml、2.4 ml、3.0 ml、3.6 ml的溶液，置于25 ml量瓶中，分别用50%乙醇溶解稀释，获得系列浓度的对照品。准确抽取对照品，各浓度各20 μl，注入液相色谱仪，依“2.2”中色谱条件测定峰面积。以淫羊藿苷进样量作为横坐标，以峰面积积分值作为纵坐标，进行标准曲线绘制。

3 结果

根据方程Y＝-5.953＋2107.944x，r＝0.999 8，提示淫羊藿苷于0.099 84～0.599 04 μg范围内存在良好线性关系。

3.1 阴性干扰试验

按供试品溶液制备法制备淫羊藿苷阴性对照品溶液，浓度14.97 μg/ml。准确抽取淫羊藿苷供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，依“2.2”中色谱条件测定，记录色谱图。结果显示，淫羊藿苷于阴性无干扰处。

3.2 精密度实验

准确抽取淫羊藿苷对照品溶液（浓度14.97 μg/ml）20 μl，注入液相色谱仪，重复进样5次，测定峰面积，RSD为1.03%，结果表明仪器精密度良好。

3.3 稳定性实验

取同供试品溶液20 μl，制备后分别于0、2、4、6、8 h测定峰面积，RSD为1.39%，测定所得结果显示供试品溶液在8 h内其淫羊藿苷稳定性均良好。

3.4 重复性试验

取同一份供试品，按同样方法制备供试品溶液，抽取20 μl溶液，测定峰面积，结果RSD为2.92%。

3.5 加样回收率试验

精密称取50 mg淫羊藿药材粉末，分为6份，分别加入对照品溶液3个量各3份，按照供试品制备完成后对其含量予以测定，结果显示淫羊藿定C及淫羊藿苷回收率分别为99.7%、102.5%，RSD分别为1.4%、1.1%，见表1。

表1 加样回收率试验结果

4 讨论

淫羊藿，小檗科植物茎叶，通常取自淫羊藿、心叶淫羊藿或箭叶淫羊藿，均为野生。少数附带取其根茎与须根。别名：羊藿叶、仙灵脾、三枝九叶草。于陕西、四川、湖北及湖南多省的山林地带[4]。其性温味辛，归于肝肾经。具强筋骨，补肝肾及祛风湿、助阳益精之临床功效。多被施用于腰膝酸软、风寒湿痹、四肢麻木以及男科阳痿等病症。淫羊藿的现代药理研究显示该药：（1）可兴奋性机能：相关动物实验显示，淫羊藿可促精液分泌，尤以叶、根药效最佳，果实次之而茎部为最弱。（2）影响血小板凝集：大鼠体外实验表明，淫羊藿可增加血小板聚集率；另有实验证实，淫羊藿中的多糖成分可通过促进血小板的生成，而增强血小板聚集作用[5-7]。（3）降血压：通过周围血管舒张作用而降低血压。（4）抗病毒：淫羊藿煎剂可直接灭活脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及Sabin Ⅰ型。（5）影响骨代谢：大鼠实验证实，淫羊藿还可预防去睾丸大鼠骨质疏松的发生。淫羊藿提取液不仅能够抑制破骨细胞活性，又可改善骨细胞功能，使钙化骨形成增加，骨形成大于骨吸收[8-10]。另外，淫羊藿对糖皮质激素所引起的骨质疏松有着良好的预防作用，联用糖皮质激素，可显著抑制糖皮质激素对骨质的吸收。（6）对骨髓及造血系统的作用：研究证实，EPS可提高DNA合成率，影响核酸代谢，提高体外培养骨髓细胞增殖率，并能使叠氮胸苷所致的不良反应（外围血白细胞数目、骨髓造血干细胞和粒单系祖细胞数量减少，脾淋巴细胞增殖和产生IL-2能力显著降低）部分或全部消失[11-12]。提示EPS能促进骨髓造血，可试用于白血病的治疗。

本研究中就高效液相色谱法测定供试品淫羊藿苷含量可行性进行实验论证。结果显示供试品淫羊藿苷在0.099 84～0.599 04μg范围内线性关系良好并无隐性干扰，供试品溶液8 h内稳定性良好。且本研究实验中依照淫羊藿苷溶解性质，经乙酸乙脂多次提取、纯化后可明显减少供试品溶液中杂质，确保实验结果准确性。在使被测成分完全提取得到保证的同时降低了样品对色谱柱的污染与干扰。此外，在本研究中，以乙腈—水（25：75，V/V）作为淫羊藿药材含量测定相中的流动相，利于实验获得良好色谱分离效果。