美洲大蠊肠道无色杆菌的分离鉴定及其抑菌活性的初步研究

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无色杆菌(Photorhabdusluminescens)为一种肠杆菌科，无色杆菌属的革兰氏阴性菌[1]，菌体细胞呈杆状，大小为0.8～2.0 μm× 2.0～10.0 μm。目前，无色杆菌主要从土壤、植物以及昆虫消化系统中分离得到，而国内外对无色杆菌的研究主要集中在其降解有机污染物的能力及其协助昆虫分解、利用有机物能力等方面的研究[2-5]，对无色杆菌的其他生物活性功能却鲜有报道。美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL)，别称“蜚蠊”，是一种在地球上至今已生存了3.5亿年，当今世界上生命力最顽强、最古老的昆虫群类之一。美洲大蠊具有繁殖速度快，栖息隐蔽，喜欢阴暗潮湿的角落等特点[6]，同时其可传播多种致病微生物，是重要的病害传播媒介，是卫生防治的主要对象之一[7]。本研究从野生美洲大蠊肠道中分离得到4株无色杆菌，并发现其对黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎杆菌、大肠埃希菌等受试菌株的生长具有一定程度的选择性抑制作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 室外捕捉的美洲大蠊成虫样品，经广东药科大学寄生虫学教研室老师鉴定，与美洲大蠊成虫体貌特征相符合，鉴定为美洲大蠊(Periplanetaamericana)；枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、肺炎克雷伯菌(ATCC 13883)、大肠埃希菌(ATCC 25922)以及黑曲霉菌(ATCC 16404)，所有受试菌株均购自广东省微生物研究所。

1.2 方法

1.2.1菌株的分离及保存 采用表面消毒法对美洲大蠊进行预处理。剪去触角、腿部和翅，从侧面将虫体的腹部切开并取出其肠道，放入匀浆器中，加入无菌水充分研磨，研磨液稀释成分别为1×10-3g/mL、2×10-3g/mL以及4×10-3g/mL的3个浓度，每个浓度设置3个平行实验室组。吸取充分研磨后的悬浮液0.2mL于高氏合成I号培养基平板上涂布均匀，并于恒温箱中28 ℃倒置培养7 d。根据无色杆菌在琼脂平板上的形态特征(菌落呈圆形，轻微隆起，淡黄色，湿润，半透明，边缘整齐，表面光滑)，挑取疑似单菌落接种于高氏合成I号培养基上进行二次纯化、再培养。将纯化后的菌株接种于菌液并与80%的甘油以1∶1的比例混匀，保存于-80 ℃备用。

1.2.2菌株的形态特征观察 经纯化活化后的菌株在高氏合成I号培养基平板上28 ℃培养3 d，经革兰氏染色后，用光学显微镜观察细菌的的形态。

1.2.3菌株16S rDNA PCR扩增、Blast比对及系统发育树的构建 根据Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒的操作步骤，对所分离得到的菌株的基因组DNA进行提取。使用通用引物[8](27f：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG；1492r：TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T)对菌株的16S rDNA基因进行扩增。50 μL的反应体系由2×Taq PCR Mix 25 μL，无菌ddH2O 20 μL，上、下游引物各2 μL，模板1 μL(空白对照组用无菌ddH2O代替，上述操作均在无菌条件下进行)。PCR扩增条件为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30s，72 ℃ 30s，共35个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。PCR产物序列检测由上海英潍捷基公司完成。将测序所得的16S rDNA基因序列与NCBI中GenBank数据库中的已知序列进行Blast比对。将16S rDNA基因序列与Ezbiocloud数据库blast比对的结果，利用Mega 7.0软件，采用最大似然值法构建系统发育树，并进行分析。

1.2.4菌株发酵粗体物抑菌活性的初步测定 挑取适当大小保存于平板的菌块，加入到种子培养基中，置于恒温摇床160 r/min, 28 ℃摇瓶培养2d，按5%的接种量将种子液接种至ISP-2发酵培养基中，并置于恒温摇床160 r/min，28 ℃摇瓶发酵7d。4000 r/min离心15 min后取上清，用等体积的乙酸乙酯对滤液萃取3次并收集上层有机相，旋蒸至干，称量样品的质量，4 ℃保存备用。按1%的接种量把枯草芽孢杆菌等受试菌株接入到10 mL液体LB培养基(真菌采用液体沙氏培养基)中，置于恒温摇床37 ℃，180 r/min培养8 h活化。在制备好的营养琼脂平板上加入5 mL混有适量受试菌液的固体LB培养基(受试菌最终浓度为1×10-8CFU/mL)。放入牛津杯，并向牛津杯中加入100 μL的待测样品(浓度为1 mg/mL)，设ddH2O为空白对照。把平板置于恒温培养箱中37 ℃培养过夜，取走牛津杯，观察其抑菌情况(每组实验设置3个重复实验)。

1.2.5菌株关键次级代谢生物合成基因和卤化酶基因的扩增与鉴定 参考Christiansen G等方法[9-11]，在GenBank数据库中检索Helogenase、NRPS和PKSI的相关氨基酸序列，利用Clustal W软件对其进行比对后，经在线软件Primer 5.0设计引物并用DNAman软件对引物进行功能评估，获得2个关键次级代谢生物合成基因NRPS(A3F：GCSTACSYSATSTACACSTCSGG；A7R：SASGT-CVCCSGTSCGGTAS)、PKS I(K1F：TSAAGTCSAACATCGGBCA；M6R：CGCAGGTTSCSGTACCAGTA)和卤化酶基因FADH2(Halo-B4-FW：TTCCCSCGSTACCASATCGGSGAG；Halo-B4-RV：GSGGGATSWMCCAGWACCASCC)的PCR扩增引物序列。根据Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒的步骤抽提菌株的基因组DNA，并分别对3个关键合成酶基因进行PCR扩增，PCR体系总体积为25 μL：模板1.0 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL。PCR扩增条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 90 s/55 ℃ 2 min/59 ℃ 2 min (FADH2/NRPS/PKS I)，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃后延伸5 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结 果

2.1菌株的形态特征观察 菌株在高氏I号固体培养基上培养5 d后的观察其生长形态特征(图1)，菌落均呈圆形、轻微隆起、湿润。革兰氏染色结果呈阴性，光学显微镜下观察菌体为微杆状，菌丝呈直杆状(图1)，其生长形态特征及革兰氏染色结果均符合无色杆菌的基本特征。

(A-B: WA5-1-11; C-D: WA5-1-16; E-F: WA5-1-17; G-H: WA5-1-54)图1 4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌在高氏一号培养基生长形态及革兰氏染色(×200)结果图Fig.1 Growth morphology on the Gao’s No.1 medium and the Gram staining results of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana

2.2菌株的分子生物学鉴定 对4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌的16S rDNA进行扩增，并在数据库Ezbiocloud中进行Blast比对。比对结果显示，4株菌株均为无色杆菌，且与无色杆菌Achromobacterxylosoxidans、Achromobacteraegrifaciens和Achromobactermarplatensis的相似度均在99.3%以上。选用Mega 7.0软件，采用最大似然值法构建4株菌株的系统发育树(图2)，发现4株菌株均与来自土壤的无色杆菌亲缘关系较近。

2.3菌株抑菌活性测定 采用牛津杯法，对4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌发酵粗提物的抑菌活性进行初步测定(表1)。其中，菌株WA5-1-11对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希菌的生长具有抑制作用，菌株WA5-1-16对枯草芽孢杆菌以及黑曲霉菌的生长具有抑制作用，菌株WA5-1-17对枯草芽孢菌、金黄色葡萄球菌以及黑曲霉菌的生长具有抑制作用，菌株WA5-1-54对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌以及肺炎克雷伯菌的生长具有抑制作用(图3)。

2.4菌株关键次级代谢生物合成基因的鉴定情况 对4株无色杆菌的关键次级代谢生物合成基因PKS I(750 bp)、NRPS(900 bp)和卤化酶基因FADH2(700 bp)进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶电泳结果显示(表2)，4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌中均能检测到2个关键次级代谢生物合成基因PKS I(750 bp)和NRPS(900 bp)，且在菌株WA5-1-54的检测到卤化酶基因FADH2(700 bp)。

图2 4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌基于16S rDNA构建系统发育树结果图Fig.2 The phylogenetic tree of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana

表1 4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌抗细菌和抗真菌能力情况表(n=3)
Tab.1 Anti-bacterial and anti-fungi activity of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana(n=3)

受试菌株菌株WA5-1-11WA5-1-16WA5-1-17WA5-1-54枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (ATCC 6633)++++金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (ATCC 25923)+-++肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883)+--+大肠埃希菌Escherichia coli (ATCC 25922)+---黑曲霉菌Aspergillus niger (ATCC 16404)-++-

(+：抑菌圈≥ 9 mm；-：抑菌圈< 9 mm)

(A：枯草芽孢杆菌；B：金黄色葡萄球菌；C：肺炎克雷伯氏菌；D：大肠埃希菌；E：黑曲霉菌；1：WA5-1-11；2：WA5-1-16；3：WA5-1-17；4：WA5-1-54)图3 4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌抗细菌和抗真菌结果图Fig.3 The anti-bacterial and anti-fungi activity of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana

表2 4株美洲大蠊肠道无色杆菌关键次级代谢生物合成基因与卤化酶基因鉴定情况表(n=3)
Tab.2 The detection of the key secondary metabolic biosynthesis genes and Halogenase gene of the four strains intestinal endogenic Achromobacter of Periplaneta americana (n=3)

菌株关键次级代谢生物合成基因PKS INRPSFADH2WA5-1-11++-WA5-1-16++-WA5-1-17++-WA5-1-54+++

(+：阳性；-：阴性)

3 讨 论

肠道微生物作为昆虫共生微生物的重要组成部分之一，近年来越来越多的研究表明，昆虫肠道微生物对其宿主的生长、发育、抗逆抗药乃至生存繁殖等方面都产生了十分重要的影响[12-15]。美洲大蠊为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属的昆虫，其进化史十分漫长，是地球上起源最早、生命力最顽强的昆虫类群之一[16]。美洲大蠊具有良好的环境适应力与抗逆性，其作为多种病原微生物的传播媒介，且其长期生活于不卫生、阴暗潮湿的环境中，却可免受病原生物的感染[17]。美洲大蠊的这些特征可能与其丰富的肠道微生物有关[18]。

本研究从美洲大蠊肠道中分离并得到了4株无色杆菌，根据沈敏雅[19]，Hinteregger C[20]等人的研究结果表明，目前国内外对无色杆菌的研究主要集中在其降解有机污染物能力等方面[21-22]。本研究通过初步鉴定这4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌的抑菌活性，发现其对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等常见的病原菌均具有一定程度的选择抑制作用，说明美洲大蠊良好的环境适应性和抗逆性可能与其内生无色杆菌具有的抑菌能力有关。微生物的大部分次级代谢产物是通过聚酮合酶(Polyketide Synthase, PKS)和非核糖体多肽合成酶(Non-ribosomal Peptide Synthetase, NRPS)途径形成结构模块产生。同时，由PKS和NRPS途径合成的化合物往往需要经过如卤化酶等修饰酶的结构修饰后，从而成为结构丰富的生物活性化合物[23-25]。因此，本研究对4株内生无色杆菌的关键次级代谢生物合成基因PKS I、NPRS和卤化酶基因FADH2进行鉴定，发现从4株无色杆菌中均能检测到2个关键次级代谢生物合成基因，且在菌株WA5-1-54中检测到卤化酶基因FADH2。这说明了4株无色杆菌可能具有分泌产生某些抗菌生物活性物质的能力。同时，在菌株WA5-1-54中检测到卤化酶基因FADH2，说明该菌株可能存在结构丰富的天然活性物质。综上所述，本研究发现这4株美洲大蠊肠道内生无色杆菌可能具有分泌某些抗菌天然活性物质的能力，并在美洲大蠊适应环境、抵抗外界病害入侵的过程中起到重要的作用。这为了解美洲大蠊的生活习性及其防治提供了一定的认识，也为后续对美洲大蠊肠道内生菌天然活性产物的分离纯化等相关研究奠定了理论基础。