一例禽腺病毒感染的病例诊断

史荣华，颜彩霞，张建军，任 丹，高 巍

(1.国药集团扬州威克生物工程有限公司，江苏扬州 225127；2.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009)

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAV)属于腺病毒科禽腺病毒属，大多数能在健康鸡、鸭、鹅等禽类体内存在且复制，一般呈隐性感染[1]。禽腺病毒分为I 、II 和III 3个群，其中I 群禽腺病毒(FowlAdenovirus Group I，FAV-I)具有共同的群抗原，分为5个种、12个血清型[2]。世界各地均有报道，FAV急性感染主要表现为包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等症状[3]。2018年4月山东某肉鸡场发生的疑似禽腺病毒感染鸡群，临床表现为心包中有淡黄色清亮液体，肝脏肿大，表面有出血点，经实验室病毒分离与鉴定为血清4型禽腺病毒感染。

1 材料与方法

1.1病料采集病料来源于山东省某鸡场，34日龄AA肉鸡，剖检疑似禽腺病毒感染，无菌采集具有典型病变的肝、脾、肾等病料组织用于病毒分离以及组织病理学观察。

1.2试验材料SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，由国药集团扬州威克生物工程有限公司实验室孵化及饲养。

DNA提取纯化试剂盒购自上海凯杰公司，2×Easy TaqSuperMix，普通琼脂糖凝胶购自北京金式金生物技术有限公司，DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，根据GenBank中I群禽腺病毒的Hexom基因序列保守区，设计合成引物，F：5′-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3′；R：5′-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。其他试剂均为国产试剂。

1.3病毒分离采集病鸡肝、脾、肾等病变组织，按1∶5 加入含适当浓度抗生素的灭菌PBS缓冲液，充分研磨，反复冻融3次后，离心取上清[4]，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，卵黄囊接种5个7日胚龄的SPF鸡胚，置37 ℃温箱孵育。每12 h照胚1次，将24 h内死亡鸡胚弃去，24 h后死亡鸡胚收取尿囊液并观察胚体是否病变，7 d后存活的鸡胚，置4 ℃冻死，收取尿囊液并观察胚体是否病变。

1.4血凝试验取30 μL收集的尿囊液用生理盐水在血凝板中先进行倍比稀释211，随后每孔加入30 μL 1%鸡红细胞；置37 ℃反应10 min。若样品孔出现鸡红细胞凝集现象，则判定为有血凝性；反之则为血凝阴性。

1.5PCR检测用DNA提取试剂盒抽提鸡胚尿囊液中的DNA，置-20 ℃备用。以提取的病毒DNA作为模板进行PCR扩增。反应体系为：DNA模板2.0 μL，2×Easy TaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上游引物和下游引物各1.0 μL。反应程序为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳处理后，置于凝胶成像系统中拍照鉴定，阳性样品送南京金斯瑞物科技有限公司进行序列测定，并将测定序列与GenBank上已发表FAdV核苷酸序列进行同源性比对。

1.6病理组织学检测取病死鸡的肝脏等组织用福尔马林固定，按文献方法[5]制作石蜡切片，苏木精-伊红染色，染色后进行组织病理学诊断。

2 结果与分析

2.1病鸡剖检症状对现场病死鸡进行剖检发现，主要表现为肝脏表面有大量出血点和出血斑(图1A)，包心，内含黄色积液(图1B)。

图1 病死鸡组织病变Fig.1 Pathological changes of dead chicken

2.2病毒分离SPF鸡胚在接种病料后，96 h内死亡2个，120 h内死亡2个，血凝试验结果表明收获的尿囊液没有血凝性，排除了流感和新城疫病毒的感染。接种病料死亡的鸡胚出现明显的病变，主要表现为胚体出血，肝脏呈黄色，有明显的出血点(图2)。

图2 接种鸡胚病变Fig.2 Pathological changes of inoculated chicken embryo

2.3PCR鉴定和序列分析PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出的目的条带与预期设定的腺病毒阳性对照的条带相符，大小约为500 bp(图3)。测序结果表明，此病毒分离株的基因序列与Genbank已发表4型FAdV序列同源性达99%，从而确定为血清4型FAdV。

注：M.DL2000 DNA Marker；1.腺病毒阳性对照；2.病毒DNA的PCR扩增产物Note：M.DL2000 DNA Marker；1.Adenovirus positive control；2.PCR amplification products of virus DNA图3 PCR鉴定结果Fig.3 PCR identification results

2.4组织病理学检测组织病理学显示：肝细胞明显减少，大量肝细胞变性、坏死(图4A)；肝细胞内可见嗜碱性包涵体(图4B)。

图4 肝脏病理变化Fig.4 Pathological changes of liver

3 结论与讨论

FAdV-I 主要侵害3-8 周龄的肉鸡，病死率最高可达80%。FAdV 既可通过种蛋垂直传播又可通过病鸡水平传播[6]。I群禽腺病毒分为12个血清型，其中在白羽肉鸡上4型和8b型禽腺病毒流行最为广泛，4型主要表现为心包积水综合征，而8b型则主要表现为包涵体肝炎[7]一些免疫抑制病，如传染性法氏囊病和传染性贫血病等混合感染会加剧家禽的发病和死亡[8]。2014—2016 年该病在我国发病范围广泛，给养禽业造成了巨大损失。

该试验从山东省某肉鸡场采集病料，根据临床解剖病变，病毒分离、血凝试验、PCR扩增及其产物序列分析、病理组织学分析，最终确诊该病例为禽4型腺病毒感染。针对此种腺病毒感染一方面疫苗预防是有效的方法，另一方面做好环境的消毒工作，减少病原的传播。一旦鸡群发病无特效药物，可增加营养和改善环境以增强体质提高抗病能力，同时添加适量抗生素防止继发感染。死亡率逐渐增大的鸡群可以紧急注射特异性高免血清或卵黄抗体。因该病目前无明确的致病机理，建议使用疫苗进行防控，选择合适血清型灭活疫苗给健康鸡群进行免疫预防，能达到90% 以上的保护效果。其中在肉鸡上，5～7 日龄和21 日龄左右进行灭活疫苗的接种，可很好控制该病的发生。该鸡场发病后选择紧急注射腺病毒卵黄抗体并适当添加抗生素进行治疗，加强鸡舍通风消毒，死亡率下降显著，7 d后鸡群稳定，几乎未见死亡病鸡。