乳酸菌胞外多糖结构解析的研究方法

邸维 张英春 易华西 韩雪 王淑梅 张兰威

摘 要 乳酸菌胞外多糖具有免疫调节和抗肿瘤、改善食品质地和口感等多种独特的功能特性，其分子结构多样性是影响功能的主要因素之一。乳酸菌胞外多糖的结构解析是研究其功能性和构效关系的前提和基础。本文根据乳酸菌胞外多糖结构解析过程中的关键步骤，总结了乳酸菌胞外多糖的分离纯化、初级结构及高级结构解析技术方法的研究进展，讨论了化学分析、仪器分析以及计算机辅助技术等多元技术方法在乳酸菌胞外多糖结构解析领域的综合运用，并对乳酸菌胞外多糖的结构研究的发展前景进行了展望。

关键词 乳酸菌； 胞外多糖； 分离纯化； 结构解析； 评述

1 引 言

多糖广泛存在于高等植物、细菌、真菌和动物体内，是生命有机体的重要组成成分。多糖不仅可为生命体提供能量，同时还参与生命科学中细胞的多种活动，并具有多种生物活性。因此，近几十年来关于多糖的活性和结构研究逐渐成为相关学科的前沿研究领域。胞外多糖（Exopolysaccharides， EPSs）作为乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）的重要次级代谢产物，其功能性已受到国内外学者的广泛关注和认可[1，2]。乳酸菌对人体安全无毒（Generally regarded as safe，GRAS），所分泌的胞外多糖（LAB-EPSs）具有独特的理化特性，可作为稳定剂、增稠剂或乳化剂等， 用于改善食品的质地和口感[3]；此外，乳酸菌胞外多糖还具有抗肿瘤[4]、抗氧化[5]、免疫调节[6]、抗菌[7]等多种生物活性，可应用于医药领域[8]。

LAB-EPSs的结构是决定其功能的基础，其结构解析和构效关系已成为研究热点和难点[9，10]。LAB-EPSs的分子量相对较大，通常在104～106 Da之间，并且结构复杂性，具有多态性，因此其结构解析较一般细菌多糖和真菌多糖更为困难，尤其是对其结构动态变化检测的研究相对有限，增加了LAB-EPSs结构解析的难度[11，12]。此外，LAB-EPSs由多种不同电荷性质和分子量的EPSs组分混合而成，研究LAB-EPSs结构的前提是获得均一性的EPSs组分，因此，分离纯化方法也是LAB-EPSs结构研究领域的重要方面[13]。

近年来，随着新型分析技术手段的不断涌现，为LAB-EPSs的分离纯化和结构解析提供了更多启示和实例[14]。本文对LAB-EPSs的分离纯化方法、一级结构和高级结构的鉴定方法、以及计算机程序CASPER（Computer assisted spectrum evaluation of regular polysaccharides）结合核磁共振（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）在LAB-EPSs高级结构解析方面的应用进行综述，旨在为LAB-EPSs的应用性基础研究提供參考。

2 乳酸菌胞外多糖的分离纯化

对LAB-EPSs进行分离纯化获得均一组分是结构解析研究的前提。目前，LAB-EPSs的分离纯化通常采用离心除去细菌体，酶法脱蛋白，有机溶剂沉淀得到粗EPSs，再通过柱层析纯化获得均一性的EPSs组分，并对所得EPSs组分的纯度进行分析鉴定[15，16]。近年来，LAB-EPSs的分离纯化效果随着层析技术的不断发展而得到明显提升。通常，LAB-EPSs的柱层析纯化多先采用DEAE-琼脂糖凝胶FF（DEAE-Sepharose Fast-Flow）层析对粗多糖中不同电荷性质的EPSs组分进行初步分离，然后采用凝胶层析对相同电荷性质的EPSs组分按分子量的不同进一步纯化，获得均一性EPSs组分，为后续结构解析提供良好的实验样品。

DEAE-Sepharose Fast-Flow层析具有流速快、高载量、稳定性好和可再生次数多等优点，根据LAB-EPSs大多为酸性多糖的特点，近年来常用于对其进行初步分离纯化[17]。初步纯化所得的EPSs可通过凝胶层析法进一步纯化，获得分子量相同的均一组分。凝胶层析不仅可根据分子量的不同将LAB-EPSs进一步分离纯化，同时能通过洗脱产物单一尖锐的峰形判定纯度，得到可供结构解析的均一EPSs组分[18]。Li等[5]利用DEAE-Sepharose Fast-Flow对植物乳杆菌LP6（L. plantarum）所产的粗EPSs进行纯化，得到两个中性（EPS-1和EPS-2）和一个酸性（EPS-3）EPSs组分，采用Sepharose CL-6B将EPS-3组分进一步纯化得到均一的EPSs组分。Miao等[19]采用DEAE-Sepharose Fast-Flow层析先将罗伊氏乳杆菌SK24.003（L. reuteri）所产的粗EPSs纯化为一个中性和一个酸性EPSs组分，然后采用Sepharose CL-2B对这两个组分进一步纯化，获得单一尖锐峰形的均一EPSs组分，最后通过NMR技术分析该组分的结构特征。近年来，随着全自动蛋白纯化系统和NGC中高压层析系统等层析技术的不断发展，为LAB-EPSs的分离纯化提供了更加精准、高效和便捷的实验平台。

3 乳酸菌胞外多糖一级结构的研究

LAB-EPSs的结构分为一级结构和高级结构（二级、三级和四级等）。一级结构包括糖基的组成、连接顺序、构型、羟基被取代情况和糖苷键的异头异构形式、糖链的分支、位置以及长短等，通常采用化学方法和仪器分析方法相结合对其进行结构解析。

3.1 化学分析法

LAB-EPSs一级结构研究的传统化学分析方法包括酸水解、高碘酸氧化、Smith降解和甲基化反应等，主要用于测定LAB-EPSs的单糖组成和比例，初步判断糖苷键连接方式和位置等，是仪器分析方法的基础。其中，酸水解主要用于确定各单糖的组成[20]，高碘酸氧化反应可根据高碘酸的消耗量和甲酸的生成量可判断糖苷键的位置、连接方式、分支度或聚合度等结构信息[21，22]。Smith降解可测定单糖的种类、连接方式和顺序以及氧环大小[23]。与上述方法相比，甲基化法在LAB-EPSs的结构解析中更为常用，该方法不仅较其他方法对样品需求量小，可确定单糖的种类和比例、各糖苷键的连接方式和位置，还可通过傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer， FT-IR）检验甲基化是否成功。但甲基化法无法对异头碳糖苷键构型和糖链中单糖残基的顺序信息进行测定[24]。然而，将甲基化的分析结果进一步结合NMR图谱可以弥补甲基化分析法的不足，且能更为直接地获得LAB-EPSs的一级结构信息。Wang等[25]通过甲基化和一维NMR图谱（1D-NMR）确定了L. plantarum 70810所产EPSs主链和侧链的连接方式。Polak-Berecka等[26]研究5种不同碳源培养基对鼠李糖乳杆菌E/N（L. rhamnosus）所产EPSs结构的影响，通过甲基化、1D-NMR、ROESY和HMBC等2D-NMR确定了该5种EPSs糖苷键主链和侧链的连接方式及顺序。

3.2 仪器分析法

目前，常用于LAB-EPSs一级结构测定的仪器分析法包括凝胶柱层析、排阻色谱、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、FT-IR以及NMR等[27]，仪器分析法可与化学分析法相辅相成，互相补充，提供更全面的信息。

3.2.2 NMR法 NMR在解析LAB-EPSs的糖苷键构型、氧环大小、单糖的种类和相对比例、糖链的连接位置和顺序等方面具有重要作用[11]。常用方法主要有1H-NMR、13C-NMR和二维NMR（2D-NMR）等。在LAB-EPSs的结构测定中，1H-NMR主要用于解决糖苷键构型问题，根据不同糖苷键构型特征将其特性进行区别[35]。13C-NMR既可确定各种碳的位移，以及单糖残基的种类、比例、取代位置和分支点，还能区别构型和构象，对于LAB-EPSs的结构解析起到决定性作用[36]。Doco等[37]最早将NMR技术引入LAB-EPSs的结构研究领域，采用高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应和1H-/13C-NMR等方法测定一株嗜热链球菌（S. thermophilus）所产EPSs的结构，并获得了该EPSs组分的主链连接顺序和方式（图2A）。随着1D-NMR技术在EPSs结构研究领域的广泛应用，一些结构相对简单的均一LAB-EPSs的结构特征被相继报道[38～40]。

2D-NMR可对LAB-EPSs的1H和13C-NMR谱进行完全归属，进而获得LAB-EPSs的全部一级结构信息。此外，将NMR图谱与甲基化分析结果进行比对，还可避免NMR谱图中一些噪声峰和杂质峰的干扰[41]。Górska-Fraczek等[6]通过1D-和2D-NMR（COSY， TOCSY， NOESY， HSQC和HMBC）结合甲基化分析结果，对约氏乳杆菌151（L. johnsonii）所产EPSs的一级结构进行测定分析，结果表明，该EPSs是由重复单元构成的线性多糖（图2B）。同时1D-和2D-NMR也可测定解析具有支链结构的LAB-EPSs组分的结构特征，Gerwig等[42]利用高碘酸氧化、甲基化分析、1D-和2D-NMR等方法，分析发酵乳杆菌TDS030603（L. fermentum）所产EPSs的一级结构，结果表明该EPSs的主链是由四糖重复单元构成，并具有不均一的半乳糖侧链（图2C）。

然而，对于一些分子量较大、結构复杂的LAB-EPSs，通过化学方法结合1D-和2D-NMR也不能完全解析其结构。Ai等[43]通过FT-IR、甲基化和1D-/2D-NMR等方法对干酪乳杆菌LC2W（L. casei）所产LCP1胞外多糖组分的结构进行解析，通过结果分析得出LCP-1组分的主链结构并推断出其中一个支链的可能构型（图2D）。近年来，随着HMQC-COSY、HMQC-TCOSY、HMQC-TOCSY、HMQC-NOESY等混合多量子谱的发展，可用于解决LAB-EPSs复杂的结构解析中不能用COSY或HMQC进行准确归属的问题，是今后对LAB-EPSs复杂结构进行解析研究的重要方向[44]。

4 乳酸菌胞外多糖高级结构研究

LAB-EPSs的高级结构是指一级糖链在有序的空间里卷曲折叠形成的有规则的空间构象[45，46]。其中，多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键结合而形成的聚合体，主要依赖其一级结构的排布；多糖的三级和四级结构则是以二级结构为基础，由糖单位的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生有规则的构象[47]。由于LAB-EPSs的结构较蛋白质、核酸等其它生物大分子更为复杂，且其空间结构具有多态性，尤其目前对其高级结构动态变化的表征技术手段十分有限。因此，对LAB-EPSs的高级结构研究仍处于起步阶段，主要表现为结构测定不够自动化、标准化和微量化[20]。随着大型精密仪器检测、计算机辅助信息化等技术在LAB-EPSs高级结构研究领域的应用，有关其高级结构复杂的数据处理、动态的图谱解析等技术难题得到不断优化。

LAB-EPSs高级结构分析的常用方法主要包括X射线衍射法（XRD）、原子力显微镜法（AFM）、高效液相色谱（HPLC）与基于高分子稀溶液理论（动＼＼静态光散射或黏度测定等）的联用技术、圆二色谱法（CD）等[48]。目前，该方面研究的最新进展主要集中于借助计算机辅助技术、光散射技术以及扫描电镜法等对其复杂结构模型的推导、多态性特征检测以及形态学特征辅助验证等[40]。

4.1 计算机辅助技术

由于LAB-EPSs内部均一性相对较差，数据处理及图谱解析难度大，当前对于其高级结构研究主要集中于一级结构相对简单均一的EPSs组分，而对于单糖组成较多、连接方式复杂的杂多糖涉猎有限[48]。近年来，计算机辅助技术在LAB-EPSs结构的NMR解谱分析领域应用发展较快，Lundborg 等[49]建立了计算机辅助液态NMR图谱解析技术，可通过比对图谱和计算耦合常数，对糖蛋白上的糖链及部分细菌多糖的一级结构进行分析。Jansson等[50]开发的计算机程序CASPER可通过数据库中已存的EPSs的单糖、二糖和三糖的1H-和13C-NMR化学位移数据预测简单均一的未知EPSs的结构波谱。近年来，CASPER已开发出扩展版本，增加了多种单糖的1H-和13C-NMR化学位移和部分多糖的2D-NMR数据信息，大大提高了复杂多糖结构测定的成功率[51]。Fontana等[52]将L. plantarum C88所产EPSs的1H-NMR、13C-NMR和乙酰化数据输入CASPER程序中，不仅快速准确的推导出C88-EPSs的双分支糖结构，同时确定了乙酰基取代基的确切位置。因此，计算机辅助技术将越来越多地应用于LAB-EPSs高级结构测定的研究，并与传统方法相结合，实现对LAB-EPSs结构进行更为精准、快捷的解析研究。

4.2 光散射技术

由于LAB-EPSs的高級结构具有多态性的特征，传统测度方法具有局限性，而多角度激光光散射仪、多角度静态光散射仪、动态光散射仪等成为目前获得LAB-EPSs高级结构的简单有效方法[48]。这些方法可通过散射光的强度变化和位移分布计算，得到LAB-EPSs的空间构象[53]。Shao等[54]利用多角度激光光散射（SEC-MALLS）和动态光散射（DLS）检测L. rhamnosus KF5所产EPSs组分S2在溶液中的形态，研究发现S2-EPSs组分在0.1 mol/L NaNO3溶液中糖链呈柔顺的随机线形构象，且通过原子力显微镜（AFM）观察也证实这一结果的准确性。此外，DLS还可用于研究LAB-EPSs的流变学特性，推动LAB-EPSs在食品工业生产中的应用。 Ayala-Hernandez等[55]通过DLS研究了乳酸乳球菌乳脂亚种JFR1（Lactococcus lactis subsp. cremoris）所产EPSs在乳清蛋白中与胶体颗粒的相互作用，结果表明该EPSs组分带负电荷，可与乳清蛋白中的胶体颗粒在酸性条件下相互作用，增加牛奶和乳制品等胶体体系的粘度。

4.3 电镜法

近年来，LAB-EPSs高级结构的形态学特征引起学者的关注，形态学特征是反映LAB-EPSs结构完整性和稳定性的重要指标[56]。扫描电镜法（SEM）可用于观察并获得EPSs的原始形态和结构特征。Ahmed[16]和Liu[40]等均对LAB中分离纯化出的EPSs进行SEM拍摄，通过观察获得其薄片状、致密性的表面特征用于辅助推测其结构的完整性等特征。随后，Saravanan等[31]将SEM拓扑图与原子力显微镜（AFM）获得的数据相结合，对LAB-EPSs的内部结构紧密状态进行定量测度，证明了具有致密性表面形态的EPSs同时也具有物理稳定性，从而证实了表面形态特征与EPSs的微观结构特征具有直接关联。此外，Di等[57]对L. casei SB27所产的两个结构相似的EPSs组分LW1和LW2的表面形态学和理化特性进行对比研究，SEM图显示，LW1和LW2多糖组分均呈薄片状并具有致密性的形态学特征，结合甲基化和FT-IR等结果说明，具有相似微观结构的EPSs可能具有相似的表面特征和理化特性。借助物理技术等新技术方法可扩充常规方法对LAB-EPSs结构研究的认识维度，从而为其结构研究提供更多的辅助性信息，是EPSs高级结构研究的重要趋势。

5 总结与展望

精确测定和解析LAB-EPSs结构的关键是获得定量且纯度高的均一组分样品，并克服动态的数据处理与复杂图谱解析等难题。传统化学方法结合NMR技术，以及NMR与计算机辅助分析技术相结合，可从多角度综合分析LAB-EPSs的结构特征。随着计算机辅助技术的发展，借助系统数据平台对LAB-EPSs结构的分子对接及分子动力学模拟、预测、解析等角度的扩展研究，为阐明LAB-EPSs的结构特征提供精准依据，将是LAB-EPSs结构研究的前沿方向。此外，随着对LAB-EPSs结构解析研究的深入，对其构效关系和作用机制的研究将得到进一步充实，并奠定坚实的基础。同时，对LAB-EPSs理化特征的精准调控能力也将得到不断提升，推动LAB-EPSs在医疗、食品、动物生物、环境治理等诸多领域进行广泛应用。

References

1 Caggianiello G， Kleerebezem M， Spano G. Appl. Microbiol. Bioty.， 2016， 100（9）： 3877-3886

2 Chen Z， Shi J， Yang X， Nan B， Liu Y， Wang Z. Int. Dairy J.， 2015， 43： 15-21

3 Zannini E， Waters D M， Coffey A， Arendt E K. Appl. Microbiol. Bioty.， 2016， 100（3）： 1121-1135

4 Liu C T， Chu F J， Chou C C， Yu R C. Mutat. Res. Genetic Toxicol. Environmen. Mutagen.， 2011， 721（2）： 157-162

5 Li J Y， Jin M M， Meng J， Gao S M， Lu R R. Carbohyd. Polym.， 2013， 98（1）： 1147-1152

6 Gorska-Fraczek S， Sandstrom C， Kenne L， Pasciak M， Brzozowska E， Strus M， Heczko P， Gamian A. Carbohyd. Res.， 2013， 378： 148-153

7 Garcia-Ruiz A， Gonzalez de Llano D， Esteban-Fernandez A， Requena T， Bartolome B， Moreno-Arribas M V. Food Microbiol.， 2014， 44： 220-225

8 Ryan P M， Ross R P， Fitzgerald G F， Caplice N M， Stanton C. Food Funct.， 2015， 6（3）： 679-693

9 Ferreira I C， Heleno S A， Reis F S， Stojkovic D， Queiroz M J， Vasconcelos M H， Sokovic M. Phytochemistry， 2015， 114： 38-55

10 DI Wei， ZHANG Lan-Wei， YI Hua-Xi， HAN Xue. China Dairy Industry.， 2017， 45（5）： 32-37

邸 维， 张兰威， 易华西， 韩 雪. 中国乳品工业， 2017， 45（5）： 32-37

11 Mende S， Rohm H， Jaros D. Int. Dairy J.， 2016， 52： 57-71

12 Kristo E， Miao Z， Corredig M. Int. Dairy J.， 2011， 21（9）： 656-662

13 Zou P， Yang X， Huang W W， Zhao H T， Wang J， Xu R B， Hu X L， Shen SY， Qin D. Molecules， 2013， 18（8）： 9933-9948

14 Salama Y， Chennaoui M， Sylla A， Mountadar M， Rihani M， Assobhei O. Desalin Water Treat.， 2015， 57（35）： 1-18

15 Ai L， Zhang H， Guo B， Chen W， Wu Z， Wu Y. Carbohyd. Polym.， 2008， 74（3）： 353-357

16 Ahmed Z， Wang Y， Anjum N， Ahmad A， Khan S T. Food Hydrocolloid.， 2013， 30（1）： 343-350

17 Xu W， Zhang F， Luo Y， Ma L， Kou X， Huang K. Carbohyd. Res.， 2009， 344（2）： 217-222

18 KANG Xue-Jun， QU Jian-Song. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis.， 2006， 7： 891-894

康学军， 曲见松. 药物分析杂志， 2006， 7： 891-894

19 Miao M， Ma Y， Jiang B， Huang C， Li X， Cui S W， Zhang T. Carbohyd. Polym.， 2014， 106（9）： 384-392

20 TIAN Hua， ZHANG Yi-Ming. China Food Additives， 2012， 2： 177-181

田 华， 张义明. 中国食品添加剂， 2012， 2： 177-181

21 Tong H， Xia F， Feng K， Sun G， Gao X， Sun L， Sun X. Bioresource Technol.， 2009， 100： 1682-1686

22 CUI Hong-Chun， JIANG He-Yuan， ZHANG Jian-Yong， KOU Xiao-Hong， YUAN Xin-Yue， LIU Xiao-Hui， GAO Qing-Qing， JIANG Yong-Wen. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2009， 37： 200-203

崔宏春， 江和源， 张建勇， 寇小红， 袁新跃， 刘晓辉， 高晴晴，江用文. 安徽农业科学， 2009， 37： 200-203

23 Yuan F， Yu R， Yin Y， Shen J， Dong Q， Zhong L， Song L. Int. J. Biol. Macromol.， 2010， 46： 436-439

24 He L， Ji P， Cheng J， Wang Y， Qian H， Li W， Gong X， Wang Z. Food Chem.， 2013， 141（2）： 946-953

25 Wang K， Li W， Rui X， Chen X， Jiang M， Dong M. Int. J. Biol. Macromol.， 2014， 63： 133-139

26 Polak-Berecka M， Choma A， Was A， Góska S， Gamian A， Cybulska J. Carbohyd. Polym.， 2015， 117（5）： 501-509

27 Zhang Z， Wang F， Wang M， Ma L， Ye H， Zeng X. Carbohyd. Polym.， 2015， 117： 980-987

28 YANG Fo-Song， LI Xue-Hua. Food Science and Technology.， 2008， 33（3）： 200-203

陽佛送， 李雪华. 食品科技， 2008， 33（3）： 200-203

29 Wu W， Zhu Y， Zhang L， Yang R， Zhou Y. Carbohyd. Polym.， 2012， 87（2）： 1348-1353

30 Wang J， Zhao X， Yang Y， Zhao A， Yang Z. Int. J. Biol. Macromol.， 2015， 74： 119-126

31 Saravanan C， Shetty P K H. Int. J. Biol. Macromol.， 2016， 90： 100-106

32 Kanmani P， Satish kumar R， Yuvaraj N， Paari K A， Pattukumar V， Arul V. Bioresour. Technol.， 2011， 102（7）： 4827-4833

33 Cui G， Zhang W， Wang Q， Zhang A， Mu H， Bai H， Duan J. Carbohyd. Polym.， 2014， 111： 245-255

34 Ye L， Zhang J， Yang Y， Zhou S， Liu Y， Tang Q， Du X， Chen H， Pan Y. Food Chem.， 2009， 112（4）： 962-966

35 Yu W， Chen G， Zhang P， Chen K. Int J. Biol. Macromol.， 2015， 82（7）： 299-307

36 Botelho P S， Maciel M I S， Bueno L A， Marques M D F， Marques D N， Silva T M S. Carbohyd. Polym.， 2014， 107： 1-6

37 Doco T， Wieruszeski J M， Fournet B， Carcano D， Ramos P， Loones A. Carbohyd. Res.， 1990， 198（2）： 313-321

38 Robijn G W， van den Berg D J， Haas H， Kamerling J P， Vliegenthart J F G. Carbohyd Res.， 1995， 276： 117-136

39 Dueas-Chasco M T， Rodríguez-Carvajal M A， Tejero-Mateo P， Espartero J L， Irastorza-Iribas A， Gil-Serrano A M. Carbohyd Res.， 1998， 307（1-2）： 125-133

40 Liu Z， Zhang Z， Qiu L， Zhang F， Xu X， Wei H， Tao X. J. Dairy Sci.， 2017， 100（9）： 6895

41 Jeener J， Alewaeters G. Prog. Nucl. Mag. Res. Sp.， 2016， 94-95： 75-80

42 Gerwig G J， Dobruchowska J M， Shi T， Urashima T， Fukuda K， Kamerling J P. Carbohyd. Res.， 2013， 378： 84-90

43 Ai L， Guo Q， Ding H， Guo B， Chen W， Cui S. Food Hydrocolloid.， 2016， 56： 134-143

44 WANG Rong-Ping， Tubuxingjiya， HAO Na， LI Xiang-Yi， Wuyundalai. Science and Technology of Food Industry.， 2016， 37（14）： 389-394

王荣平， 图布兴吉雅， 郝 娜， 李相沂， 乌云达来. 食品工业科技， 2016， 37（14）： 389-394

45 Zhang B， Wei K L， Zou Y， Mabusela W， Johnson Q， Michaelsen T E， Paulsen B S. J. Ethnopharmacol.， 2014， 152（2）： 340-348

46 Bajpai V K， Rather I A， Majumder R， Shukla S， Aeron A， Kim K， Kang S C， Dubey R C， Maheshwari D K， Lim J. Bangl. J. Pharmacol.， 2016， 11： 1-23

47 LI Yan， WANG Zhao-Mei， GUO Si-Yuan. Guangdong Chemical Industry.， 2005， 32： 78-81

李 艳， 王兆梅， 郭祀远. 广东化工， 2005， 32： 78-81

48 XU Hang， ZHU Rui， LIU Wei， GAO Xiang-Dong. Progress in Pharmaceutical Sciences.， 2015， 5： 364-369

徐 航， 朱 锐， 刘 玮， 高向东. 药学进展， 2015， 5： 364-369

49 Lundborg M， Widmalm G. Anal. Chem.， 2011， 83（5）： 1514-1517

50 Jansson P E， Kenne L， Widmalm G. Carbohyd. Res.， 1987， 168（1）： 67-77

51 LIU Yu-Hong， WANG Feng-Shan. Food and Drug.， 2007， 9（8A）： 39-43

劉玉红， 王凤山. 食品与药品， 2007， 9（8A）： 39-43

52 Fontana C， Li S， Yang Z， Widmalm G. Carbohyd. Res.， 2015， 402： 87-94

53 DONG Zhao-Xia， LIN Mei-Qin， LIN Ming-Yuan， WU Zhao-Liang. Polym. Bull.， 2001， 5： 25-33

董朝霞， 林梅钦， 李明远， 吴肇亮. 高分子通报， 2001， 5： 25-33

54 Shao L， Wu Z， Tian F， Zhang H， Liu Z， Chen W， Guo B. Int. J. Biol. Macromol.， 2015， 72： 1429-1434

55 Ayala-Hernandez I， Hassan A， Goff H D， de Orduna R M， Corredig M. Int. Dairy J.， 2008， 18： 1109-1118

56 LV X， Yi L， Dang J， Dang Y， Liu B. Food Control.， 2014， 46： 264-271

57 Di W， Zhang L， Wang S， Yi H， Han X， Fan R， Zhang Y. Carbohyd. Polym.， 2017， 171： 307-315

Abstract Exopolysaccharides （EPSs）， produced by lactic acid bacteria （LAB）， have been used primarily to improve the quality and taste of food， also possess a variety of unique biological functions， such as immunoregulation and anti-tumor activities. The diversity of molecular structural characteristics of LAB-generated EPSs represents one of the main factors responsible for this plethora of functions. Accordingly， the structural analysis of the EPSs produced by LAB is both a prerequisite and basis for examining its functional and structure-activity relationships. In this article， we summarized the current progress of key methodologies involved in the structural analysis of LAB-generated EPSs， including their isolation， purification， primary structure and advances in structural research. A comprehensive discussion regarding the application of chemical analysis， instrument analysis and computer aided technology in the structure analysis of LAB-generated EPSs was provided. Further， the future development of the research on the structure of LAB-generated EPSs was presented.

Keywords Lactic acid bacteria； Exopolysaccharides； Isolation and purification； Structure analysis； Review

（Received 21 March 2018； accepted 8 April 2018）