miR-128通过RECK靶向作用影响乳腺癌细胞的生物学行为

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(1.宝鸡市人民医院普外科,陕西 宝鸡 721000;2.宝鸡市中心医院血液肿瘤科,陕西 宝鸡 721000)

微小RNA(miRNA)是由约22个核苷酸组成的小非编码RNA，负调节真核生物中的基因表达[1-3]。miRNA基因是哺乳动物中最丰富的调控基因类型之一；越来越多的证据表明，miRNA是动物发育的关键调节者，并参与人类疾病，如多种类型的恶性肿瘤[4-5]。miR-128在各种实体肿瘤中过表达，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌和甲状腺癌[6-7]。此外，已有研究发现miR-128的高表达水平与肺癌和胰腺肿瘤的不良预后相关联[8-10]。所有这些证据都以miR-128在人类癌症中作为致癌miRNA(oncomiR)起作用。然而miR-128在乳腺癌细胞中的作用机制在很大程度上是未知的。本研究旨在探讨miR-128对MCF-7乳腺癌细胞生长和裸鼠体内成瘤行为的影响，验证RECK是否为miR-128的靶点，并探讨miR-128在这个过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 组织样本和实验器材

2014年3月至2015年3月于宝鸡市人民医院收集60例组织标本，其中包括乳腺癌癌组织和相邻的正常组织，所有样本均立即保存于液氮中。手术后，-80 ℃储存直到RNA提取。所有组织诊断都具有病理和/或细胞学证据。脂质体Lipofectamine 2000购自上海吉凯基因，Trizol购自美国Ambion公司，PCR试剂盒购自美国Kapa公司，荧光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司，荧光素酶报告载体由Promega公司合成，Transwell小室购自美国Millipore公司，Matrigel购自Bio-Rad。该研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 细胞株和培养

人类乳腺癌细胞系(MCF-7)获自中国科学院细胞库(中国上海)。所有细胞在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素或100 mg/mL链霉素的Dulbecco’s改良的Eagle培养基中培养，培养条件：37 ℃的含5%CO2的恒温孵箱中。

1.3 RNA分离和定量实时PCR(qRT-PCR)分析

使用TRIzol试剂从组织或细胞中分离总RNA，并按照制造商的说明书用逆转录酶(TaKaRa)和寡核苷酸(dT)合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒进行实时PCR。实时PCR的条件如下：94 ℃ 10 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 30 s退火，72℃ 15 s，然后40个循环。本实验使用miR-128的特异性引物(正向引物5’TTTTCGAGGCGAGAAAATCG-3’以及反向引物5’ATGGAGGCTAGGGCGAAATC-3’)作为对照，用特异性引物(正向引物5’-CATCACCATCAGGAGAGTCG-3’和反向引物5’-TGACGCTTGCCCACAGCCTT-3’)扩增U6。

1.4 细胞转染

miR-128模拟物和相应的阴性对照(miR-NC)分别转染到实验细胞株中。按照生产商的说明，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将模拟物或质粒转染到细胞中。转染后24 h，收集细胞并进行基因表达分析、细胞增殖、周期和侵袭测定。

1.5 双荧光素酶报告分析

RECK的野生型(Wt)和突变型(Mut)3’非转录区(3’-UTR)由生物技术公司提供设计制备，并克隆到pMIR-Report质粒中，称为RECK-WT和RECK-Mut。对于荧光素酶测定，将1×105个细胞铺板并在12孔板中培养以达到约70%汇合。细胞与miR-128模拟物或NC共转染，检测RECK Wt/Mut报告质粒的荧光表达活性。使用双荧光素酶报告基因测定试剂盒，转染48 h后进行萤光素酶测定。实验重复3次。

1.6 裸鼠皮下成瘤实验

裸鼠成瘤实验：将不同组的2×107个乳腺癌细胞分别离心，用50 μL PBS稀释重悬待用。10只4周左右的裸鼠，分为miR-128-siRNA组和NC组，每组5只，将2组乳腺癌细胞分别注射入左侧腋下，2周后观察肿瘤形成情况。6周后将肿瘤剥除，测量并称重肿瘤。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 miR-128在细胞株中的慢病毒转染效率对RECK蛋白的影响

本研究通过qPCR分析来检测miR-128的转染效率，结果显示，与NC组相比，MCF-7细胞转染miR-128-siRNA之后的miR-128表达显著更高。Western blot实验检测RECK蛋白的表达水平发现，抑制miR-128的表达后RECK蛋白表达水平相对下调[(8.36±1.11)vs.(2.09±0.86)，P<0.05]，差异有统计学意义(图1)。

*:与NC组比较，P<0.05

图1miR-128在细胞株中的慢病毒转染效率对RECK蛋白的影响

2.2 miR-128与RECK在乳腺癌细胞中的关系

本实验进一步研究miR-128在乳腺癌、TargetScan、Pictar-Vert和microRNA发展中的作用机制和致癌作用。在组合预测的3个软件中，本实验发现RECK是miR-128的潜在靶标。RECK 3’UTR与miR-128的结合位点相似(图2a)，表明RECK可能是miR-128的直接靶标。因此通过双荧光素酶实验了解miR-128和RECK之间的相互调控关系，我们构建了含有与荧光素酶基因融合的野生型或突变型RECK的3’UTR的质粒(图2b)，将野生型或突变质粒共转染至具有miR-128m或miR-128m NC的293细胞中。miR-128显著降低RECK的野生型3’UTR的荧光素酶活性，而RECK的突变型3’UTR的荧光素酶活性不被miR-128抑制，表明miR-128可以直接结合RECK的3’UTR。上述实验结果显示RECK是乳腺癌细胞中miR-128的直接靶标，并且mRNA降解涉及miR-128抑制RECK的表达。

2.3 miR-128对乳腺癌细胞体外成瘤行为的影响

为了阐明表达miR-128对MCF-7细胞的生长抑制机制，本实验分析了其在裸鼠体内成瘤能力的变化。裸鼠体内成瘤实验结果发现，抑制miR-128的表达导致乳腺癌细胞在裸鼠体内成瘤行为，肿瘤的体积和质量都受到一定程度的抑制，提示miR-128可以直接抑制裸鼠体内移植瘤的生长(图3)。

a:miR-128与RECK的相关结合位点；b：荧光素酶活性

图3 miR-128对乳腺癌细胞体外成瘤行为的影响

2.4 裸鼠体内移植瘤中RECK蛋白的表达情况

如图4所示，可见NC组图RECK蛋白的表达阳性率明显升高，与NC组相比，细胞核中的染色比例明显较处理过的乳腺癌细胞在裸鼠内成瘤组织中RECK蛋白的表达水平相对减弱，用miR-128-siRNA转染的MCF-7细胞的RECK蛋白表达阳性率，提示miR-128可能调控裸鼠体内RECK蛋白的表达。

a:NC组；b:miR-128-siRNA组

3 讨论

目前乳腺癌是全世界常见的女性恶性肿瘤之一，在发展中国家，乳腺癌是主要死因之一[11]。乳腺癌早期易出现转移，晚期的治疗手段有限，且治疗效果通常不佳，因而提高乳腺癌患者的早期诊断率和治疗效果尤为重要，关于乳腺癌发生发展过程的机制探讨及新型治疗靶点的研究尤为关键。

miR-128能通过靶向肿瘤抑制因子TP53INP1和RhoA分别促进胰腺肿瘤发展和乳腺上皮细胞迁移及侵袭[7-8]。另外，miR-128通过在转基因小鼠模型中靶向Ship和C/EBPβ诱导B细胞恶性肿瘤[9-10]。鉴于miRNA通常调控大量目标，推测可能有更多miR-128靶标参与肿瘤发生[11]。尽管已发现miR-128在乳腺癌中上调，但其在乳腺肿瘤发生中的作用尚未确定。研究miR-128在乳腺癌中的表达情况及相关作用机制，可以为乳腺癌的临床侵袭发展等情况提供一定的理论参考。

miR-128基因座位于被称为B细胞整合簇的区域内，最初被认为是与淋巴瘤相关的原癌基因[12]。在B细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病中BIC/miR-128表达上调，miR-128首先涉及造血系统恶性肿瘤的发生[13-14]。此外，本研究显示，miR-128的表达下调可以显著抑制MCF-7细胞的生长并促进细胞凋亡，这与Ji等[15]探讨的使用miR-128抑制剂阻断miR-128抑制细胞生长并促进细胞凋亡的结果一致。但是，miR-128如何在细胞内发挥功能，从而解释miR-128对MCF-7细胞生物学行为的影响目前尚未见相关研究。

本实验研究miR-128在乳腺癌细胞中的作用靶点，TargetScan、Pictar-Vert和microRNA软件组合预测中发现RECK是一个潜在的miR-128的靶标。因此，我们将注意力集中在RECK的表达效果上。p53主要通过转录诱导参与多个过程(包括细胞周期检查点和细胞凋亡)的靶基因发挥其肿瘤抑制功能[16]。RECK也是p53的靶基因之一，是位于染色体8q22上的p53诱导型细胞应激反应基因[17]。其表达依赖于广泛型p53的激活[18]。最初，RECK表达可以直接诱导小鼠急性胰腺炎的体内发展。肿瘤抑制基因RECK的过度表达可以诱导细胞周期阻滞，并增强p53介导的细胞凋亡[19]。在本实验研究中，我们还发现RECK的异位表达通过抑制细胞凋亡和调控细胞周期进程来促进MCF-7细胞的生长。Walsh等[20]对RECK的表达进行免疫组化检测，在81例乳腺癌中，与正常乳腺组织相比，45例(55.6%)RECK的表达降低。RECK的表达水平与肿瘤组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移阳性和p53异常表达呈负相关关系[20]。此外，有报道显示RECK的阳性率随着胃癌的进展而下降，RECK蛋白阴性与胃癌的侵袭性病理表型显著相关[21-23]。这些观察结果表明RECK通过其抗增殖和促凋亡活性在抑制包括乳腺癌在内的肿瘤进展中发挥关键作用。本实验结果表明，miR-128的过表达不仅导致RECK的下调，在裸鼠体内RECK蛋白的表达也受miR-128的调控，提示miR-128显著降低了RECK 3’UTR的相对荧光素酶活性，进一步支持了两者相互调控的关系。

综上所述，miR-128在乳腺癌细胞系中表达上调，miR-128表达的上调可以进一步促进乳腺癌细胞的增殖和裸鼠体内的生长，并且提示miR-128和RECK可能成为乳腺癌的潜在治疗靶标。后续实验拟研究miR-128调控相关信号通路的关系及对乳腺癌细胞运动能力的影响，完善相关研究机制。