DEPTOR在直肠癌中的表达及对预后的影响

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(1.蚌埠医学院附属蚌埠市第三人民医院肿瘤内科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科，安徽 蚌埠 233004；3.蚌埠医学院第一附属医院急诊外科，安徽 蚌埠 233004；4.蚌埠医学院第一附属医院胃肠外科，安徽 蚌埠 233004；5.蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科，安徽 蚌埠 233004；6.蚌埠医学院第一附属医院消化内科，安徽 蚌埠 233004)

直肠癌是高发的消化系统恶性肿瘤，一经诊断，手术是目前唯一有望获得根治的治疗方法，但术后仍然有一定比例的患者发生复发或转移[1-2]。迄今为止，直肠癌的发病机制尚不明确，这是限制直肠癌诊疗水平提高的根本因素。对直肠癌病理组织学的研究有望为探索直肠癌的发生与发展提供线索，为临床诊疗提供参考。DEPTOR是新近发现的一种可与雷帕霉素靶蛋白(mechanistic TOR/mammalian, mTOR)结合的富含DEP结构域的蛋白质，为一种内源性mTOR抑制剂，主要功能是在体外及细胞试验中抑制mTOR的活性[3-5]。现有研究证实，DEPTOR在多发性骨髓瘤、前列腺癌、肝癌等组织中高表达，且提示预后不良[6-7]。但DEPTOR在直肠癌中的表达情况及与预后的关系尚未充分研究。本研究尝试以直肠癌患者及手术标本为研究对象，采用免疫组化检测DEPTOR在直肠癌组织中的表达，并进一步分析其与临床、病理组织学及预后的关系，以期为临床诊疗提供参考，为探索直肠癌的发病提供线索。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2011年1月至2013年1月在我院接受直肠癌根治术的102例患者，采用免疫组化法检测癌组织及癌旁组织中DEPTOR水平，并计算光密度值(integrated option density，IOD)。以患者癌组织中DEPTOR-IOD中位数为界将患者分为DEPTOR高表达组及低表达组。纳入标准：①均经病理检查明确诊断为直肠腺癌；②未接受过术前化疗及放射治疗；③无远处转移并成功实施直肠癌R0切除；④术后5年生存资料完整。排除标准：①合并其他组织起源的恶性肿瘤；②临床资料缺失；③手术标本蜡块遗失。

1.2 临床资料及DEPTOR检测方法

通过电子病历系统回顾分析患者的临床资料，包括性别、年龄、体质指数(body mass index，BMI)、病理诊断结果、术前癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)及糖类抗原199(carbohydrate antigen 199，CA199)。DEPTOR的检测采用免疫组化法，收集直肠癌术后癌组织及癌旁组织标本，予10%甲醛固定，经脱水处理后再予石蜡包埋。连续切厚度为4 μm的切片，在60 ℃的环境下烘干及脱蜡后分别滴加兔抗人多克隆抗体过夜，予以苏木素染色及脱水后经透明树胶封片。每张切片在200倍光学显微镜下选取5个不同视野观察免疫组化染色结果，通过软件(Image-Pro Plus 6.0)计算目标蛋白DEPTOR的IOD值，取平均值作为单张切片的最终结果，并以癌旁组织IOD值为基线分别计算癌组织和癌旁组织的相对IOD值作为后期统计分析的数值。采用Western blot法评估癌组织及癌旁组织DEPTOR表达水平，取癌组织和癌旁组织充分研磨，提取蛋白，Bradford定量，100 ℃煮沸变性，每孔加入35 μg提取蛋白，经电泳、转膜、封闭，加入DEPTOR和β-actin(1∶1 000，Abcam公司)一抗稀释液，4 ℃摇床12 h后滴加二抗，洗膜，滴加ECL显影液，使用通过软件(Image-Pro Plus6.0)定量分析条带灰度值。

1.3 观察指标

DEPTOR在直肠癌患者癌组织及癌旁组织中的表达差异；分析DEPTOR高表达组与低表达组在临床及病理组织学上的差异；分析直肠癌患者DEPTOR的表达与外周血CEA及CA199水平的相关性；分析DEPTOR表达水平与患者手术预后的关系。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 DEPTOR在直肠癌患者癌组织及癌旁组织中的表达差异

DEPTOR在癌组织中的相对IOD值为(2.73±0.21)，高于其在癌旁组织中的相对IOD值(1.00) ；两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。Western blot证实DEPTOR在癌组织中的表达水平高于癌旁组织，两者比较差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

a:癌组织苏木素染色；b：癌旁组织苏木素染色；c：癌组织与癌旁组织DEPTOR的IOD值； *：P<0.01

图1直肠癌组织与癌旁组织DEPTOR表达水平比较(×200)

a：癌组织；b：癌旁组织

2.2 DEPTOR高表达组与低表达组在临床特征上表达的差异

在直肠癌中，DEPTOR的高表达组与低表达组患者在性别、年龄、BMI差异无统计学意义(P>0.05)；而在肿瘤直径、T分期、N分期及分化程度差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。将单因素分析所得阳性结果纳入Logistic回归模型进行多因素分析，结果显示T分期、肿瘤直径是影响DEPTOR表达的独立风险因素(P<0.05)，见表2。

表1 2组患者临床特征表达的差异(n=51，例)

表2 影响DEPTOR表达的多因素分析

2.3 直肠癌患者DEPTOR的表达与外周血CEA及CA199水平的相关性

DEPTOR高表达组患者外周血中CEA水平显著高于低表达组，差异有统计学意义(P<0.05)；DEPTOR高表达组患者外周血中CA199水平与低表达组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 2组患者外周血中CEA、CA199水平比较(n=51)

2.4 直肠癌患者癌组织中的 DEPTOR的表达水平与外周血CEA水平的相关性分析

直肠癌患者DEPTOR表达水平与外周血CEA水平呈现显著正相关(r=0.509 ，P<0.01)，见图3。

图3直肠癌患者癌组织中的DEPTOR的表达水平与外周血CEA水平的相关性

2.5 DEPTOR表达水平与患者手术预后的关系。

采用Kaplan-Meier生存曲线法对DEPTOR表达水平与患者手术预后的关系进行分析，组间比较通过Log-rankχ2检验发现，直肠癌DEPTOR高表达组患者术后5年累计复发率显著高于DEPTOR低表达组，其5年累积死亡率显著高于DEPTOR低表达组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图4。

3 讨论

直肠癌是全球第三大高发恶性肿瘤，调查显示每年约有130万新增直肠癌病例，每年死于直肠癌患者人数达69万[8]。我国是直肠癌高发国家，近年来随着环境污染、食品安全及人口老龄化，直肠癌的发病率呈现逐年上升趋势[9-10]。直肠癌的发生伴随一系列复杂而渐进的病理生理过程，从肠黏膜损伤、炎症、上皮内瘤病变直至发展为原位癌，如未得到有效治疗，则进一步进展至浸润癌[11-12]。直肠癌早期多无特异性临床改变，这是导致直肠癌早期诊断较为困难的主要原因，相当一部分患者就诊时已错过最佳治疗时期，也是部分患者预后不良的主要原因之一[13]。直肠癌一经诊断，手术是有望根治的治疗手段[14]。随着以手术为主的肿瘤综合治疗水平提高，直肠癌术后5年生存率得到了一定提高，但仍然有一部分患者因术后复发、转移而死亡[15]。临床上对于判断直肠癌手术后的预后并无可靠指标，此外从疾病的发生、进展及治疗等角度分析，深入对直肠癌病理组织学的认识是提供其诊疗水平的关键点[16]。DEPTOR作为一种内源性mTOR抑制剂，是来源于染色体8q24分子量为48 kDa的蛋白质[17]，并且在多种疾病(如肥胖、多发性骨髓瘤、肝癌、甲状腺癌等)中过表达，主要功能是参与细胞增殖过程[18-20]。此外，有文献报道DEPTOR与多发性骨髓瘤、甲状腺肿瘤及肝恶性肿瘤的复发率也有相关联，且与患者的总体生存率呈负相关，是肿瘤不良预后的一个指标[21-22]。但我们发现DEPTOR在直肠癌组织学领域的研究并不充分。DEPTOR是否在直肠癌组织中异常表达，以及是否可用以判断患者的手术预后等问题均需要进一步探索。

a: 5年累积复发率；b：5年累积死亡率

因而我们设计此研究，以直肠癌患者及直肠癌手术切除标本为研究对象，分析DEPTOR在直肠癌组织中的表达改变，与临床及其他病理组织学改变的关系，并进一步分析其是否有望成为评估手术预后的指标。

本研究首先通过免疫组化法评估癌组织及癌旁组织DEPTOR表达水平，结果显示直肠癌组织中的DEPTOR表达水平高于癌旁组织，这提示DEPTOR可能参与到直肠癌的发生与发展，通过Western blot进一步证实了DEPTOR在癌组织中高表达。同时我们对DEPTOR表达的高低与临床特征的关系进行了分析，数据显示DEPTOR高表达组直肠癌患者肿瘤直径、T分期、N分期及分化程度与低表达组患者比较有显著差异，这提示DEPTOR与直肠癌的进展、转移及恶性程度有关。此项结论同样在乳腺癌中得到了证实，如Parvani等[23]的研究显示，DEPTOR在乳腺癌中过表达，并且与细胞增殖相关。本研究进一步通过将影响DEPTOR在癌组织中表达的阳性单因素结果纳入Logistic回归模型进行多因素分析，结果显示T分期、肿瘤直径是影响DEPTOR表达的独立风险因素，提示DEPTOR的表达与直肠癌的侵袭、增殖等均密切相关，但具体机制有待于进一步探索。CEA是上皮源性肿瘤的标志物，也是临床用以判断直肠癌进展、预后及复发等的常用指标[24-25]。我们分析了直肠癌组织内DEPTOR的表达水平与外周血CEA的相关性，意外发现两者呈显著正相关关系，提示DEPTOR可能在直肠癌的恶性行为中扮演重要角色。同时，本研究通过Kaplan-Meier生存曲线法分析DEPTOR表达水平与患者手术预后的关系，采用Log-rankχ2检验发现，直肠癌DEPTOR高表达组患者5年累积复发率及5年累积死亡率均显著高于DEPTOR蛋白低表达组。这一研究结果提示DEPTOR在直肠癌中的表达水平影响患者的预后，而DEPTOR的表达有望成为辅助判断直肠癌患者手术预后的指标。

本研究虽然取得一些发现，但仍然存在以下不足：由于研究对于临床、病理等资料的完整性要求较高，因而纳入的样本量有限，所得结果仍需进一步扩大样本量以验证；本研究属于回顾性研究，仍然需要开展前瞻性研究以进一步明确DEPTOR在直肠癌发生、发展中的作用及对预后的影响。

综上所述，DEPTOR在直肠癌中高表达，并与外周血CEA水平呈正相关，DEPTOR的表达水平与肿瘤大小、浸润、转移相关，且提示手术预后不良。