菲牛蛭营养成分分析与评价

戚敏，杨秀娟，陶琳丽，陈琛，曹胜雄，刘廷丹，张曦

（云南农业大学动物科学技术学院，云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明650201）

菲牛蛭（Poecilobdella manillensis），别名马尼拟医蛭，俗名金边（铜边）蚂蟥，属医蛭科，牛蛭属，广泛分布于我国广西、广东、海南等地区[1-2]。菲牛蛭是水蛭的一种，而水蛭是一味传统动物药，初载于《神农本草经》，有破血、通经、散瘀的功能；主治血瘀经闭腹痛、症瘕积聚，跌打损伤[3]。菲牛蛭不仅具有抗凝血的效果、还具有抗血栓、抗肿瘤、抗炎、降血脂、以及治疗心脑血管疾病的功效[4]。研究发现，动物药中的氨基酸、多肽、蛋白质不仅是营养成分，大多数被科学证实是动物药中的特效成分[5]。脂肪酸，矿物元素也具有特定的营养价值与生理功能。近年来，由于人们对心血管药物的迫切需求，人们开始重视对菲牛蛭等吸血蛭类的研究，但研究主要集中于菲牛蛭有效物质的分离鉴定以及作用机理，对于其蛭体成分分析较少。因此，本试验对菲牛蛭蛭体常规营养成分、氨基酸组成、脂肪酸组成及矿物元素组成进行测定与分析，为菲牛蛭资源及营养保健食品、药品的开发利用提供一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

由云南海瑞迪生物制药有限公司提供的成体引种菲牛蛭作为试验素材，将活体菲牛蛭进行称重后置于-20℃条件下迅速致死，再放入冷冻干燥机内去除水分，进行水分测定，样品经粉碎机打成粉末后备用。检测前，将样品再次放入冷冻干燥机内制备为绝干样。

1.2 主要仪器及试剂

LC-20AT高效液相色谱仪、GC-2014高效气相色谱仪、AA-6880F原子吸收分光光度计：日本岛津（中国）有限公司；SCIENTZ-10ND冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；索氏抽提器：云南省科仪化玻有限公司；JK9830自动凯氏定氮仪：济南精密科学仪器仪表有限公司；SX2-4-10箱式电阻炉：上海崇明实验仪器厂；AL104电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。甲醇（优级纯）、乙腈（色谱纯）：tedia company.USA；18种脂肪酸甲酯标准品（色谱纯）：美国NU-CHEKPREP公司。

1.3 检测方法

1.3.1 常规营养组成测定

水分含量测定采用冷冻干燥法。

水分含量X/%=[（Mb-Ma）-（Mc+Md）/2]/（Mb-Ma）×100

式中：Ma为自封袋的袋重，g；Mb为新鲜样品+自封袋的总重，g；Mc、Md为冻干后无水分的样品和袋的总重，g。

粗蛋白含量测定使用凯氏定氮法，参照GB/T 9695.11-2008《肉及肉制品氮含量测定》。粗脂肪含量测定，使用索氏抽提法测定，参照GB/T 9695.7-2008《肉及肉制品总脂肪含量测定》。粗灰分含量测定，使用干灰化法测定，参照GB/T9695.18-2008《肉及肉制品总灰分测定》。

1.3.2 氨基酸含量测定

氨基酸测定，使用高效液相色谱法进行检测。

样品前处理：取0.3 g绝干样品，采用酸水解法对样品进行水解，水解后使用0.02 mol/L盐酸溶液定容至100 mL，取200 μL样品溶液、标准溶液置于1.5 mL离心管内，分别加入三乙胺乙腈溶液100 μL、异硫氰酸苯脂乙腈溶液100 μL至每个离心管中，混匀，室温静置1小时后加入正己烷400 μL至各离心管，震荡后静置 10 min。取下层溶液（PTC-AA）200 μL，加 800 μL超纯水稀释，摇匀，用0.22 μm针筒式滤膜至自动进样品瓶中。

分析条件为色谱柱：博纳艾杰尔Venusil氨基酸分析专用柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）流动相流速为1.00 mL/min；洗脱梯度见表 1；柱温：40.0 ℃；进样体积：20 μL；检测波长：254 nm。

表1 流动相梯度Table 1 The mobile phase gradien

1.3.3 脂肪酸含量测定

脂肪酸测定，采用高效气相色谱法进行测定。

样品前处理：采用硫酸-甲醇酯化法进行样品前处理，称取1 g～2 g左右的样品置于25 mL鸡心瓶中，加入10 mL浓度为10%硫酸甲酯液，在水浴锅上70℃回流1 h，室温冷却后，加2 mL正己烷萃取，充分震荡，取上清液经0.22 μm针筒式滤膜过滤后备测。

分析条件为色谱柱：RtR-2560（100 mm×0.25 mm×0.2 μm）。载气：高纯氮气。气体流量：氮气40 mL/min，氢气40 mL/min，空气400 mL/min。柱温：240℃进样口（Split，SPL）温度：240℃。分流比：10.0。氢离子火焰检测器（Flame ionization detector，FID）温度：250℃。色谱柱升温程序：起始温度110℃，保留3 min；然后以4℃/min升温至240℃，保持50min。进样量：1 μL。

1.3.4 矿物元素含量测定

矿物元素测定，使用元素采用原子吸收分光光度法测定。

样品前处理：样品灰化完全后加入体积比为1∶1盐酸溶液2.5 mL溶解，并转移到50 mL容量瓶中，钙含量的测定使用氯化镧溶液定容，其他用去离子水定容，随机将定容好的试样液先用快速定性滤纸过滤，然后将滤液再用0.22 μm水系滤膜过滤，得到滤液用于钙、铁、锌、铜元素的测定；从上述滤液中准确吸取80 μL于10 mL容量瓶中，用去离子水定容后用于镁元素测定。

原子吸收光光度计工作条件详见表2。

表2 原子吸收分光光度计工作条件Table 2 Atomic absorption spectrophotometer’s working conditions

1.4 氨基酸营养评价方法

采用氨基酸比值系数法进行氨基酸营养评价[6-8]：根据1973年联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）提出的人体必需氨基酸模式与鸡蛋全蛋氨基酸模式[9]，通过公式（1）、（2）、（3）分别计算氨基酸比值（ratio of amino acid，RAA）、氨基酸比值系数（ration coefficient of amino acid，RCAA）、氨基酸比值系数分（score of ratio coefficient of amino acid，SRCAA），其中CV为RCAA的变异系数。根据计算结果对菲牛蛭氨基酸营养价值进行对比和分析。

2 结果与分析

2.1 常规营养测定结果与分析

菲牛蛭4种常规营养测定结果见表3。

表3 菲牛蛭4种常规营养成分（鲜样）Table 3 Four kinds of routine nutritional components of Poecilobdella manillensis（fresh sample） %

由表3可知，鲜体菲牛蛭粗蛋白含量为16.70%、粗脂肪为1.35%、灰分为1.33%、水分含量为80.55%。常见禽蛋粗蛋白含量约为12%，鱼虾约为17%、瘦肉约为20%；常见肉类脂肪含量约为2.3%～11.8%[10]。菲牛蛭粗蛋白高于禽蛋、低于瘦肉、与鱼虾粗蛋白含量相近，脂肪含量低于常见肉类。猪、牛、羊3种哺乳动物血液中的粗蛋白含量约为17%～18%、粗脂肪含量约为0.3%～0.4%、灰分含量0.8%～1.1%、水分含量约为80%[11]。菲牛蛭蛭体粗蛋白与水分含量与这3种动物血液十分接近，而粗脂肪与灰分含量略高于3种动物血液，从常规营养的角度来看，菲牛蛭粗蛋白含量与鱼类相当，营养成分与家畜血液相近。

2.2 氨基酸测定结果与分析

菲牛蛭17种氨基酸测定结果见表4。

表4 菲牛蛭与其他4种水蛭的17种氨基酸含量（绝干样）Table 4 The amount of 17 amino acids in the Poecilobdella manillensis and the other 4 hirudos（dry sample） %

由表4可知，试验所测定的菲牛蛭17种氨基酸总量（TAA）为66.09%，其中必需氨基酸（EAA）含量为24.37%，非必需氨基酸含量（NEAA）为41.72%。与日本医蛭、蚂蟥、柳叶蚂蟥[12]和宽体金线蛭[13]4种水蛭相比，菲牛蛭TAA、EAA、NEAA含量最高。蛋白质的营养价值不仅取决于氨基酸含量高低，还取决于必需氨基酸的组成比例[14]。本研究中，菲牛蛭EAA/TAA的值为36.87%，接近于FAO/WHO标准中40%的推荐值，EAA/NEAA为58.41%，接近FAO/WHO标准中60%的推荐值，具有良好的氨基酸组成比，说明菲牛蛭氨基酸组成比例平衡，营养价值高。

自然界中的氨基酸有20多种，其中天门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸9种氨基酸在一般植物中含量少，且有些人体内不能合成，是维持机体氮平衡所必须的，称为药用氨基酸（MAA）[15]。谷氨酸是哺乳动物脑内重要的神经递质，天冬氨酸在预防心脏病、高血压等疾病起到重要作用；在医学上谷氨酸、天冬氨酸用于降低血氨，消除自由氨的毒性作用，保护肝脏以及心脏，恢复其功能[16-17]。而赖氨酸是一种人体必需氨基酸，能够促进人体大脑神经再生性细胞的合成、增进食欲[18]、治疗出血性脑血管病[19]，是以谷物为主食人群的最为缺乏的氨基酸[20]。亮氨酸可以平衡机体能量代谢功能，对于肥胖症、高血脂症具有防治作用[21]。菲牛蛭蛭体的谷氨酸含量最高，为9.97%，其次为天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、精氨酸，MAA含量为43.44%占TAA总量的65.73%，菲牛蛭MAA含量高，菲牛蛭所具有的预防与治疗心血管疾病及降血脂的功效或许与MAA高含量的特点有关。此外，菲牛蛭含量最高的5种氨基酸均为MAA，结果与日本医蛭、蚂蟥、柳叶蚂蟥[12]的测定结果一致，但与宽体金线蛭[13]不同。且李军[22]、丁月珠[23]测定数种水蛭抗凝血效果时发现：菲牛蛭抗凝血效果最佳；菲牛蛭、日本医蛭等吸血蛭类抗凝血效果远高于非吸血蛭类的宽金线蛭。菲牛蛭等吸血蛭类的抗凝血效果或许与其氨基酸组成具有一定关系。

两种参考模式下菲牛蛭的氨基酸营养评定结果见表5。

表5 两种参考模式下菲牛蛭的RAA、RCAA和SRCAA（冻干粉）Table 5 RAA，RCAA and SRCAA of Poecilobdella manillensis in the FAO/WHO pattern and the whole egg reference pattern（freezedried powder）

根据氨基酸比值系数法计算出的RCAA值越接近1，说明该蛋白的氨基酸越接近所对比模式氨基酸，当RCAA＞1时，说明该必须氨基酸相对过剩，当RCAA＜1时，说明该必须氨基酸相对不足；若某种蛋白质氨基酸种类齐全，比例合理，越接近FAO/WHO氨基酸模式要求，则说明该蛋白质营养价值越高，能提供人体营养需求[7]。通过表5可知，在FAO/WHO模式下，除赖氨酸与蛋氨酸+半胱氨酸外，菲牛蛭蛭体苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸的RCAA值都十分接近1，说明其氨基酸组成较为均衡。在全蛋模式下，菲牛蛭的蛋氨酸+半胱氨酸、苯丙氨酸的RCAA值相对低于全蛋模式，赖氨酸高于全蛋模式，其余氨基酸接近于全蛋模式。菲牛蛭的氨基酸模式更加接近于FAO/WHO模式，且FAO/WHO模式的SRCAA评分高于全蛋模式。无论在FAO/WHO模式还是在全蛋模式下，菲牛蛭的第一限制性氨基酸均为蛋氨酸+半胱氨酸。

2.3 脂肪酸测定结果与分析

菲牛蛭18种脂肪酸测定结果见表6。

表6 菲牛蛭18种脂肪酸含量（绝干样）Table 6 The contents of 18 fatty acids in Poecilobdella manillensis（dry sample） mg/g

由表6可知，试验所测定的18种脂肪酸总量为27.86 mg/g，饱和脂肪酸（SFA）含量为 12.92 mg/g，不饱和脂肪酸（USFA）含量为15.13 mg/g，必需脂肪酸含量为5.49 mg/g。SFA中的月桂酸和肉豆蔻酸含量与血液中胆固醇的含量呈显著正相关，被认为是导致冠心病（coronary heart disease，CHD）的主要因素，而棕榈酸能降低血清中的胆固醇含量[24]，硬脂酸能有效降低血栓和动脉硬化发病概率[25]，调节胆酸生成[26]，有利于身体健康。菲牛蛭的月桂酸、肉豆蔻酸含量极低，棕榈酸、硬脂酸含量高，占18种脂肪酸总量的40%左右，从SFA的角度来评价，菲牛蛭的SFA是有益的。USFA由MUFA与PUFA共同构成，MUFA具有降血糖、调节血脂、保护心脏等功效，其中最具代表性的油酸能够保护脂蛋白免受氧化，防止动脉损伤[27]；PUFA具有抗心血管疾病、降低血脂、抗癌以及促进生长的作用，畜禽肉中的PUFA含量较少，尤其缺乏亚油酸、亚麻酸[28-30]。菲牛蛭USFA占18种脂肪酸总量的50%以上，虽然几乎不含亚麻酸，但油酸、亚油酸含量达5.93 mg/g、2.68 mg/g，有益脂肪酸含量较丰富，对人体心脑血管健康具有积极作用。

2.4 矿物元素测定结果与分析

菲牛蛭5种矿物元素测定结果见表7。

表7 菲牛蛭5种矿物元素含量（绝干样）Table 7 The contents of 5 mineral elements in Poecilobdella manillensis（dry sample） mg/g

由表7所示，菲牛蛭5种矿物元素总量为16.804 mg/g，其中人体常量元素钙、镁元素含量分别为12.044、2.357 mg/g，人体微量元素铁、锌、铜含量分别为 1.015、1.362、0.026 mg/g，钙元素含量最高，5 种矿物元素含量呈现钙＞镁＞锌＞铁＞铜的规律。菲牛蛭矿物元素的含量与规律同方富永[31]、苗艳丽[32]研究的结果一致。钙、镁元素不仅构成机体骨骼，同时也是多种酶的激活因子；铁是动物血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素和多种酶的重要组成成分，在呼吸与生物氧化过程中起重要作用；锌是机体多种酶的构成与激活剂，对动物大脑功能、机体免疫功能、动物机体繁殖性能有重要的影响；铜在机体内生化功能为催化作用，参与人体氧化还原作用，具有维持正常造血功能、保护中枢神经系统健康的功能[33-34]。菲牛蛭矿物元素含量高，对人体健康具有积极作用。

中药的微量元素含量与其药效关系密切[34]。试验所测定的菲牛蛭铁、锌、铜元素含量均高于决明子、三七、红花[36]等8味治疗心血管疾病中草药含量，高于龙葵、白英、昆布[37]等7味抗癌中草药含量，同时高于同为水蛭类的日本医蛭、蚂蟥、柳叶蚂蟥及金边蚂蟥（宽体金线蛭）[38]的含量。研究证明，菲牛蛭的抗凝血效果优于日本、欧洲医蛭、优于宽体金线蛭[22-23]。一些蛋白质不仅由氨基酸构成，还由非氨基的矿物元素、糖类、酯类等组分一同构成，菲牛蛭抗凝血效果优于其他水蛭，其活性蛋白含量与构成可能与其高矿物质的特点有关，这有待进一步的研究。

3 结论

菲牛蛭粗蛋白含量为16.7%、灰分为1.33%、粗脂肪为1.35%、水分含量为80.55%。菲牛蛭氨基酸TAA的值为66.09%，EAA为24.37%，NEAA为41.72%，氨基酸组成比例平衡；其中EAA/TAA的值为36.87%，EAA/NEAA为58.41%，符合FAO/WHO推荐值，具有良好的氨基酸组成比；MAA含量为43.44%，MAA/TAA为65.73%，药用氨基酸含量高；菲牛蛭的氨基酸模式接近于FAO/WHO模式，氨基酸评分好。菲牛蛭棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸含量丰富，USFA占18种脂肪酸总量的50%以上，有益于心脑血管健康。菲牛蛭富含人体所需的钙、镁、铁、锌、铜5种矿物元素，矿物元素含量较一般中草药高。菲牛蛭营养丰富，营养组成极具特点，可以根据菲牛蛭营养特点进行保健食品以及药品的开发。