一种配制型块菌苹果醋的研制

吴树坤，黄治国，卫春会，宗绪岩，邓杰

（四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000）

块菌是属子囊菌门的一类大型真菌[1]，也是世界上最珍贵的药食用菌之一，通常需要与木本植物形成共生关系才能得以生长[2]。块菌营养成分丰富，含有多种易被人体吸收的氨基酸、无机盐[3]和有促进免疫功能和抗肿瘤活性的多糖等[4]，块菌中含有的神经酰胺具有较好的保湿作用，可广泛运用于美容行业[5]，其含有的α-雄烷醇化学结构与人体性激素相似，具有调节女性月经周期等功能[6]。此外，还可作为辅料制成各类食品，备受美食界喜爱[7]。无论作为保健食品还是功能药物都极具价值，故块菌素有“林中黑钻石”的美誉[8]。

苹果醋作为苹果深加工的产物，具有苹果的典型风味且营养价值高于普通食醋，其特有的风味可使其同普通饮料一样可直接饮用。苹果醋含有丰富的有机酸[9]和数种人体必需的氨基酸[10]、维生素等物质[11]，具有调节血糖[12]、血压，促进食欲[13]、软化血管[14]、抗氧化[15-18]等功能，其含有的乙酸等能进入机体参与三羧酸循环缓解身体疲劳[19]，而丰富的抗坏血酸则可增加人体免疫力，延缓衰老的功能[20]。目前，关于保健果醋研制的报道较多[21-24]，但鲜有以感官评价为研制标准且对自身产品中活性物质清晰阐明的报道。本研究拟用苹果酿制成醋，以感官评价为标准，通过正交试验优化苹果醋与块菌提取物及蔗糖的调配比例，并检测其α-雄烷醇、氨基酸及挥发性成分的含量。研制一款不仅具有苹果-块菌混合果香味，而且在口感上又能适应多数消费者，此外还具有一定保健功能的利口果醋，此产品具有较好的市场前景和经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜红富士苹果、块菌：市售；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌由四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室提供。

乙醚（分析纯）、食用酒精：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、硫酸铜、柠檬酸（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦公司；L－8900型氨基酸自动分析仪：日本HITACHI公司；DK-98-1型电子恒温水浴锅：天津泰新特仪器有限公司；WYT-ⅡA型手持折光仪：成都市格纳丝商贸有限公司；SG260-A型榨汁机：好夫人电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苹果醋的酿制工艺

1.3.1.1 工艺流程

1.3.1.2 操作要点

苹果汁的制备：将新鲜无腐烂的苹果用清水洗净并削皮去核，切成小块浸泡在0.05%的VC溶液中进行护色，随后榨汁。

成分调整：使用手持折光仪用蔗糖将苹果汁糖度调整为15%，用柠檬酸将pH值调整为3.5。

酒精发酵：将活化好的酵母（0.2%安琪干酵母，4%葡萄糖在37℃活化15 min，再以33℃活化1 h～2 h）以10%的比例接种至灭菌（温度控制在80℃～85℃，保持30 min）的苹果汁中，发酵温度控制在28℃，每天旋转发酵罐2次～3次，并测定果汁糖度和酒精度的变化。

醋酸发酵：将苹果酒加热至70℃左右保持15 min，冷却后将其酒精浓度调整为6%（20℃），再向发酵罐中以10%的比例接入活化的醋酸菌（3%乙醇，0.25%醋酸菌，1%葡萄糖，1%酵母膏，0.5%CaCO3于40℃，140 r/min活化48 h）。发酵温度37℃，每天检测酒精度与醋酸的变化。

澄清：采用加热澄清法[25]，即将发酵液在80 s～90 s内加热到80℃左右，然后急速冷却至室温，随后用硅藻土作助滤剂过滤。即得苹果原醋。

1.3.2 块菌多糖的提取

1.3.2.1 工艺流程

1.3.2.2 操作要点

浸提：以块菌∶40%乙醇溶液=1∶5（g/mL）的比例浸提30 min，每隔5分钟搅拌1次，过滤后，滤渣再重复浸提两次。

浓缩：将块菌提取液体积浓缩至与初始块菌质量一样的值。即得用于调配的块菌提取液。

1.3.3 理化指标的测定[26]

酒精度的测定：酒精计法；糖度的测定：斐林试剂法；酸度的测定：酸碱滴定法。

1.3.4 α-雄烷醇的测定[27]

1）样品预处理

由于块菌中α-雄烷醇含量极低，检测前需将200 mL用于调配的块菌提取液与100 mL重蒸乙醚充分振荡混合进行液液萃取，静止分层后，取上层溶液，并重复萃取一次，最后用旋转蒸发仪浓缩至1 mL。立即进行气相色谱-质谱联用仪（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析。

2）α-雄烷醇的标准曲线绘制

将10 mg的α-雄烷醇标准品用丙酮溶解，定容到10 mL，然后再配制成浓度分别为 20、50、100、150、200 μg/mL的α-雄烷醇标准品，用GC-MS定量检测，绘制标准曲线。

3）α-雄烷醇的检测

气相色谱（GC）条件：DB-WAX毛细管色谱柱（60.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度 230℃；升温程序为40℃保持3 min，10℃/min升到180℃，再以20℃/min升到230℃保持10 min；载气99.999%氦气，载气流速为 0.8 mL/min，进样量 1 μL；分流比：20 ∶1。

质谱（MS）条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量 70 eV，离子源温度 230 ℃，四极杆150℃，传输线温度230℃，全扫描模式，扫描质量范围25 amu～500 amu，溶剂延迟3 min。

1.3.5 块菌苹果醋饮料调配方法

采用L9（34）正交试验，以苹果醋、块菌提取液、蔗糖为影响因素，选择出苹果醋块菌饮料的最佳调配组合。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.3.6 苹果醋的感官评定方法

按照正交试验的原料比例进行块菌苹果醋的配制，制得9组样品。然后，邀请10位视觉、嗅觉、味觉良好的专业人员进行感官评定，评定标准见表2，每组样品的感官评分取平均值。

1.3.7 氨基酸的测定

最优调配比例的块菌苹果醋中游离氨基酸的测定方法参照文献[28]。

1.3.8 块菌苹果醋中挥发性风味成分的测定

以乙酸丁酯作为内标，对最优调配比例的块菌苹果醋中挥发性风味成分进行半定量，具体方法参照文献[29]。

表2 感官评定标准表Table 2 Standard table for sensory evaluation

1.4 数据分析

单因素试验每组重复3次，试验结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 20软件进行方差分析；正交试验采用极差分析。

2 结果与分析

2.1 苹果醋酿制过程酒精度、糖度及酸度的变化

2.1.1 酒精发酵过程酒精度和糖度的变化

本试验研究苹果汁酒精发酵过程酒精度和糖度的变化，结果见图1。

图1 酒精发酵过程酒精度和糖度的变化Fig.1 The changes of alcohol content and sugar content at alcohol fermentation process

如图1所示，苹果汁的糖含量在发酵的前5天均每天显著减小（p＜0.05），而酒精含量在发酵的前5天均每天显著增加（p＜0.05）；这是由于发酵前期苹果汁中糖含量充足且有一定的溶氧，各种营养物质充足，有利于接种的酵母迅速生长和代谢。但发酵至6天后，苹果汁中糖含量和酒精含量的变化均不显著（p＞0.05），发酵至第7天糖含量降至2.9%，酒精含量升至5.3%vol；这是由于后期发酵环境变得恶劣，溶氧不足，营养物质匮乏，使酵母的生命活力降低，故而酵母代谢受阻，因此糖含量和酒精含量变化缓慢。故可推断苹果汁酒精发酵的1 d～5 d为主发酵期。本试验结果与卫春会等[30]对苹果醋的研究结果一致。

2.1.2 醋酸发酵过程中酸度和酒精度的变化

本试验研究了苹果醋醋酸发酵过程中酸度和酒精度的变化，结果见图2。

图2 醋酸发酵过程中酸度和酒精度的变化Fig.2 The changes of acidity and alcohol content at acetic acid fermentation process

如图2所示，苹果酒的酒精含量在发酵的前4天均显著降低（p＜0.05），而总酸含量在发酵的前4天均每天显著增加（p＜0.05），这是由于发酵前期苹果酒中底物充足，使醋酸菌生长并消耗酒精代谢产生醋酸。但发酵至4天后，苹果酒中总酸含量的变化不显著（p＞0.05），而在发酵至5天后，酒精含量的变化也不显著（p＞0.05），发酵至第 6 天酒精含量降至 1.43%vol，总酸含量升至21.6 g/L，这是由于发酵后期酸度的增加且营养物质贫乏，使醋酸菌生长代谢活力降低[31]。故可推断苹果醋醋酸发酵的1 d～4 d为主发酵期。

2.2 块菌苹果醋饮料的调配结果

正交试验采用蔗糖、块菌提取液和苹果原醋通过不同的比例进行调配，并根据表2标准进行感官评价。评分结果见表3。

由表3可知，块菌苹果醋饮料的调配过程中，随着蔗糖添加量增加，感官评分先降低后升高；随着块菌提取液和苹果醋量的增加，感官评分均逐渐增加。通过极差分析可得，各因素对块菌苹果醋感官影响的主次顺序为块菌提取液＞蔗糖＞苹果醋。块菌苹果醋最优的调配条件为A3B1C3，即蔗糖7 g，快菌提取液11 mL，苹果原醋34 mL。而试验组中评分最高的为第7组（94分），且其调配比例与分析所得的最优条件一致，故无需再进行验证试验。

表3 正交试验结果表Table 3 The results table of orthogonal test

2.3 块菌提取液中α-雄烷醇的检测

2.3.1 α-雄烷醇的标准曲线

本试验以α-雄烷醇作为标准品，用气相-质谱联用仪对不同浓度的标准品进行分析，对不同浓度的标准品用气相色谱定量分析得到的色谱数据，用标准品检测的浓度对应的峰面积制到标准曲线（图3），并得到回归方程为y=293 084x+60，决定系数R2＝0.984 1。

图3 α-雄烷醇标准曲线Fig.3 Standard curve of alpha male alkanol

2.3.2 块菌提取液中α-雄烷醇的含量

通过气相色谱检测，α-雄烷醇的峰面积为11 304，另一个α-雄烷醇的同分异构体的峰面积为414 674，由线性回归方程可得，α-雄烷醇的浓度为0.038 4 μg/mL，α-雄烷醇同分异构体的浓度为1.145 μg/mL，即块菌中α-雄烷醇的含量为0.019 2 μg/100 g，其同分异构体的含量为0.707 μg/100 g。由于块菌中α-雄烷醇的含量极低，难以检测，且目前关于块菌中α-雄烷醇的检测方法报道较少。王冠等[27]采用液体发酵法发酵松露，再对发酵液进行α-雄烷醇的检测，其α-雄烷醇含量最高可达123.5 ng/mL。但此法无法解释α-雄烷醇是由发酵产生还是块菌中自身所有。

2.4 块菌苹果醋中游离氨基酸的含量

根据2.2中所得的块菌苹果醋最佳调配比例进行组合，并对其进行各游离氨基酸的含量的测定，结果见表4。

表4 各游离氨基酸的含量Table 4 Content of free amino acids

如表4所示，块菌苹果醋中一共检测出12种氨基酸，氨基酸总含量为288.43 mg/100 mL，其中包括赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸6种必需氨基酸，且必需氨基酸的含量为32.41 mg/100 mL，占氨基酸总含量的11.24%，甲硫氨酸可能因含量较低，未被检出。苹果醋中氨基酸的来源主要为苹果自身含有和发酵过程中产生的氨基酸，张海涛等[10]的研究表明，苹果汁通过发酵，会增加其氨基酸的种类，如赖氨酸、异亮氨酸等。这些氨基酸很大程度上提高了苹果饮料的营养价值。

2.5 块菌苹果醋中挥发性风味成分的测定

根据2.2中所得的块菌苹果醋最佳调配比例进行组合，并对其挥发性风味成分进行分析，结果见表5。

表5 挥发性风味成分的含量Table 5 Content of volatile flavor components

续表5 挥发性风味成分的含量Continue table 5 Content of volatile flavor components

如表5所示，一共检测出24种挥发性风味成分，总含量为46.72 mg/100 mL，其中包括15种酯类物质，占总数的62.5%，总酯含量为11.215 mg/100 mL，占总挥发性风味含量的24%。经感官评价，该块菌苹果醋具有苹果和块菌的混合果香味，香味饱满且无刺激味。酯类物质主要来自原料和发酵过程中产生，在果醋、果酒及饮料中均是主要的呈香物质[32]。且在果醋、果酒挥发性风味成分的研究中，酯类物质的检测也是必不可少的[33-34]。

3 结论

本试验通过L9（34）正交试验优化块菌苹果醋的调配比例，研究结果表明当调配比例为蔗糖7 g，快菌提取液11 mL，苹果原醋34 mL时，综合感官评分最高；此比例调配出的块菌苹果醋饮料的色泽靓丽，滋味协调，且具有苹果和块菌的混合果香味，香味饱满且无刺激味。同时根据最优调配比例，分析了块菌苹果醋中氨基酸含量和风味成分含量，共检测出了12种氨基酸（含量为288.43 mg/100 mL），其中包含6种必需氨基酸（含量为32.41 mg/100 mL），而必需氨基酸在人体一旦缺乏，将会影响人体的生理机能，使其抵抗力下降等[35]。此外还检测出了24种风味物质，其中包含15中酯类物质，其香气不仅带有苹果的果香还具有块菌中特殊的香味。此外，块菌中α-雄烷醇及其同分异构体的含量分别为 0.019 2 μg/100 g 和 0.707 μg/100 g，α-雄烷醇属于类固醇物质，与其同分异构体结构相似，均为稠和四环化合物。由此可以推断它们在某些功能方面可能具有相似的作用。综合试验结果，本试验研制的块菌苹果醋不仅香味浓郁，满足大众口感，而且还具有丰富的氨基酸和其他功能物质，为利口、保健苹果醋饮料的开发提供了一条新的途径。