响应面优化黄芪多糖的提取工艺

梁子敬，张景艳，冯海鹏，张凯，王磊，王旭荣，张康，李建喜

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃兰州730050）

黄芪（Radix Astragali），又名绵芪，为豆科黄芪属 多年生草本植物，分为膜荚黄芪和内蒙古黄芪两种，主要产于内蒙古、甘肃、黑龙江和山西等地。其用于药材迄今已有两千多年的历史，同时也是老百姓常食用的纯天然品。通过研究人员近年来对黄芪的化学成分、药理活性的研究，发现黄芪中含有多糖、蛋白质、氨基酸和黄酮等多种成分，其中多糖成分是主要的生物活性成分之一[1]。黄芪多糖（Astragalus polysaccharides）主要由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖组成，其具有免疫调节[2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗病毒[5]、抗炎[6-7]和保肝[8]等活性，特别以免疫调节功能最为突出[9]。

目前关于黄芪多糖的提取工艺，主要以热水浸提法和纤维素酶解法等传统溶剂法和酶解法为主，但其耗时、易使成分失活的弊端一直存在。近些年逐步兴起的超声波辅助提取法[10]、微波辅助提取法[11]等新技术解决了耗时和维持生物活性的问题，并且由于成本低，易操作的特点使其较传统提取工艺优势更为明显。因此利用单因素和响应面法对黄芪多糖的提取工艺进行优化，旨在为黄芪多糖能更合理地开发和利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

膜荚黄芪根：兰州市黄河中药材市场；无水乙醇及其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DFY-500型摇摆式高速中药粉碎机：温岭市大机械有限公司；标准60目筛：浙江上虞市金鼎标准筛具厂；Allegra X-15R台式冷冻离心机：贝克曼库尔特有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；KQ-600DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LGJ-10F型真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；BS 224 S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取工艺路线

膜荚黄芪→粉碎机粉碎→经60目筛子筛→称重10 g→按相应液料比加纯水→按相应提取功率和提取时间进行超声→经纱布滤过后浓缩→3倍体积无水乙醇过夜沉淀→离心后，沉淀经无水乙醇清洗后再用纯水清洗，冻干→称重。

1.3.2 计算公式

1.3.3 单因素试验

在提取时间分别为 20、40、60、80、100 min，提取温度分别为 40、50、60、70、80 ℃，功率分别为 120、240、360、480、600W，液料比分别为 5∶1、10∶1、15∶1、20 ∶1、25∶1（mL/g）的条件下，按照1.3.1的方法和 1.3.2的得率计算方法，进行提取时间、提取温度、提取功率、液料比4个因素对黄芪多糖得率的影响试验。

1.3.4 响应面优化试验设计

结合单因素试验结果，选取提取时间、功率、液料比3个影响因素，再根据三因素三水平的响应面法，分别用 X1、X2、X3代表 3 个因素，以-1、0、1 代表变量的水平，对自变量进行编码（表1）。其中Xi变量编码值。采用多元回归设计方法，以多糖得率（Y，%）作为响应值，通过Box-Behnken响应面分析确定最佳提取条件。

表1 试验编码和试验参数对照关系Table 1 The comparison relationship between encode and actual concentration of factor

2 结果与分析

2.1 最佳单因素条件

2.1.1 提取时间单因素试验

在提取温度为 60℃、液料比为 15∶1（mL/g）、功率为360 W条件下，选取提取时间分别为20、40、60、80、100 min进行提取时间因素对黄芪多糖得率的影响试验，见图1。

图1 提取时间对多糖得率的影响Fig.1 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

由图1可知，多糖得率在提取时间从20 min至80 min之间呈递增的趋势，并且提取时间在80 min时达到较大值，往后趋于平缓。表明提取时间在一定范围内可以增加多糖得率，但时间过长会导致多糖结构的破坏。因此，结合多糖得率以及在节省时间的考虑下，选择较优的提取时间为80 min。

2.1.2 提取温度单因素试验

在提取时间为 60 min、液料比为 15 ∶1（mL/g）、功率为360 W条件下，选取提取温度分别为40、50、60、70、80℃进行提取温度因素对黄芪多糖得率的影响试验，见图2。

图2 提取温度对多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

由图2可知，多糖得率在提取温度从40℃至80℃之间呈递增的趋势，并且提取温度在80℃时达到最大值。表明在一定范围内，提取温度越高，多糖得率越大。因此，选择较优的提取温度为80℃。

2.1.3 提取功率单因素试验

在提取时间为60 min、提取温度为60℃、液料比为15∶1（mL/g）条件下，选取功率分别为120、240、360、480、600 W进行功率因素对黄芪多糖得率的影响试验，见图3。

图3 提取功率对多糖得率的影响Fig.3 Effect of power on the extraction rate of polysaccharides

由图3可知，多糖得率在提取功率从120 W至600 W之间呈依次递增的趋势，并且提取功率在600 W时达到最大值。多糖得率从480 W至600 W放缓，可能是由于功率过大而破坏了多糖结构。因此，结合多糖得率和实际操作选择较优的提取功率为480 W。

2.1.4 液料比单因素试验

在提取时间为60 min、提取温度为60℃、功率为360 W 条件下，而液料比分别为 5 ∶1、10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1（mL/g）下进行液料比因素对黄芪多糖得率的影响试验，见图4。

由图4可知，多糖得率在料液比从5∶1（mL/g）至20∶1（mL/g）之间呈依次递增的趋势，并且料液比在20∶1（mL/g）时达到最大值，而后多糖得率开始下降。因此，选择较优的液料比为20∶1（mL/g）。

图4 液料比对多糖得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.2 响应面优化多糖提取工艺

2.2.1 Box-Benhnken设计试验结果与分析

根据Box-Behnken原理设计试验，结合单因素试验结果确定因素的水平范围，将多糖得率作为响应值，进行三因素三水平的响应面分析，见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

由表2可知，当提取时间为60 min，提取功率480 W，液料比20∶1（mL/g）时，黄芪多糖的得率最高为6.215%。采用Design Expert 8.0软件对数据进行二次多项回归拟合，模型拟合结果为Y=5.79+0.38X1+0.46X2+0.5X3+0.22X1X2+0.12X1X3+0.42X2X3-0.85X12-1.26X22-0.37X32，R2=0.965 2。方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance results

由表3可知，该模型回归极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），且 R2=0.965 2，R2Adj=0.920 5，说明该模型与试验拟合较好。另外，模型中的一次项X1、X2、X3，二次项 X12、X22、X32和交互项 X2X3的 P 值均＜0.05，表明该试验的各因素以及因素间的交互作用对黄芪多糖的得率有显著影响。由F值可知，各因素对黄芪多糖提取率变化的贡献大小为：提取功率＞液料比＞提取时间。

2.2.2 响应面及等高线结果

通过回归模型，可以分别得到任意两因素以及其交叉作用对黄芪多糖得率的等高线图和响应面图。时间和液料比对多糖得率影响见图5，时间和功率对多糖得率的影响见图6，液料比和功率对多糖得率的影响见图7。

由图5可知，当提取时间一定时，随着液料比的增大，多糖的提取量呈现先递增后递减的趋势，反之，当液料比一定时，随着提取时间的增加，多糖的提取率呈现先递增后趋于平缓。表明液料比对多糖提取率影响较大，且两因素交互作用较显著。

图5 提取时间和液料比对多糖得率的交互作用的等高线和响应面Fig.5 Ultrasonic treatment time and liquid-solid ratio on the interaction polysaccharides yield of a response surface plot and contour line

图6 提取时间和提取功率对多糖得率的交互作用的等高线和响应面Fig.6 Ultrasonic treatment time and ultrasonic power on the interaction polysaccharides yield of a response surface plot and contour line

由图6可知，当提取时间一定时，随着提取功率的增大，多糖得率呈现出先递增后平缓的趋势，反之亦然，当提取功率一定时，随着提取时间的增加，多糖的提取率也呈现出先递增后趋于平缓。

图7 液料比和提取功率对多糖得率的交互作用的等高线和响应面Fig.7 Ultrasonic liquid-solid ratio and ultrasonic power on the interaction polysaccharides yield of a response surface plot and contour line

由图7可知，当液料比一定时，随着提取功率的增大，多糖的得率呈现出递增的趋势，而当提取功率一定时，随着液料比的增加，多糖的得率呈现出先递增后趋于平缓，表明液料比和功率对多糖得率影响较大，且两因素交互作用显著。

2.2.3 验证试验

通过Design Expert 8.0软件分析的得到黄芪多糖得率的最优工艺条件：提取时间86.81 min，液料比21.84∶1（mL/g），功率 591.94 W，得率为 6.18%。参考最优条件，结合实际后确定最终优化方案为：提取时间 87 min，液料比 22∶1（mL/g），提取功率 600 W。根据最终优化方案进行验证试验，得到黄芪多糖的得率为6.07%，与模型的理论值相差1.78%，由此可见，应用该模型改进超声波提取黄芪多糖是可行的。

3 结论

本文采用Design Expert 8.0软件，通过响应面分析得到多糖得率和提取时间、提取功率和料液比因素的模型方程，各因素对黄芪多糖得率变化的贡献大小依次为提取功率、液料比和提取时间，且液料比与功率交互作用最为显著。最佳提取工艺参数为提取时间87 min，液料比 22 ∶1（mL/g），提取功率 600 W，得率为6.07%。因此，在保证得率的前提下，利用超声波提取法使得黄芪多糖的提取更为高效。