3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯材料促进小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

李海洋 许士俊 张宏家

心肌梗死是临床上常见且严重的疾病，心肌细胞坏死后无法再生。干细胞移植能够通过分化成损伤部位的细胞从而达到治疗疾病或者改善预后的目的。但是，由于细胞移植后没有适宜的载体，细胞流失、坏死严重，治疗效果下降。因此，寻找一种能够模拟细胞生长环境并且可以促进细胞生长、增殖和分化的载体至关重要[1]。胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)能够分化成所有三胚层细胞[2]，具有广泛的全能性，被大量应用在临床医学、再生医学领域。聚羟基脂肪酸脂(PHA)，3-羟基丁酸-3-羟基己酸共聚酯(PHBHHx)由微生物合成[3]在体内能够自我降解，具有良好生物相容性，前期研究表明由PHBHHx制成的细胞补片不仅能与骨髓间充质干细胞相互融合，而且能够促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[4]，本文通过将mESC接种到PHBHHx膜上，探讨此生物材料对mESC增殖和分化的影响，为mESC进一步应用于临床治疗心肌梗死奠定实验基础。

材料与方法

1.材料 (1)干细胞：小鼠胚胎干细胞(mESCs)来R1干细胞系。(2)主要试剂：高糖DMEM(Gibco)、5%血清替代品(SR，Gibco)、L-谷氨酰胺(Gibco)、青链霉素(Gibco)、丝裂霉素C(Sigma)、1%的非必需氨基酸(Gibco)、0.1mmol/Lβ- 巯基乙醇(Gibco)、基质胶(BD Pharmingen)磷酸盐缓冲液(PBS，Gibco)、明胶、0.05% 胰酶(Gibco)。(3)主要仪器 CO2培养箱(Thermo，HERA cell 150i)、低速控温离心机(Thermo Scientific CL10)、6孔板/24孔板/96孔板细胞培养皿(NUNC)、高速控温离心机(Thermo)、冻存管(NUNC)、6 cm/10 cm 细胞培养皿(NUNC)、液氮罐(Thermofisher)、电动移液器(Thermo Scientifi c FinnpipetteC1)、50 mL/15 mL 离心管(NUNC)、低粘附性培养皿、超净台、显微镜、水浴锅。

2.实验方法 (1)制备诱导多能干细胞的滋养层细胞 将怀孕13 d左右的昆明白鼠通过拉颈处死，无菌条件下，用弯镊将子宫摘除，用PBS将血渍洗去。用剪刀将子宫和胎膜剪开，把胚胎取出，然后把胚胎的头部和内脏剪除，经过PBS充分洗涤，把组织剪成碎块(体积在1 mm3以下)，经过滤网，滤除大块的组织块，留取滤过液，然后放置在离心管中，大约安放5～10min，待分层后，把上清液去除，把含0.25%胰酶+0.04%EDTA溶液加到离心管中，约1mL，轻柔地吹吸，大约消化2min，之后终止消化(把等体积的MEF培养液加到离心管中)，随后离心，800r，5min左右，留取沉淀。将细胞重悬于滋养层上，密度大约为5×105/mL,在5%CO2，37℃的细胞培养箱中培养，当细胞长至90%的融合度后进行传代，将细胞传代三次后，将10μg/mL的丝裂霉素C加入培养液中，继续培养2.5h，然后将细胞培养液吸除，加入PBS，洗去残存的死细胞和细胞培养液，加入适量的胰酶将细胞进行消化，离心4min，转速800，将离心后的细胞重新悬浮于细胞培养基中，接种到经过明胶处理的100mm培养皿中，密度约为5×104/mL。

(2)小鼠胚胎干细胞的培养 将冻存在液氮中的小鼠胚胎干细胞取出，迅速解冻，放到离心管中进行离心，速度800r，时间4min，把冻存液吸出，丢弃，加入2mL干细胞培养基重悬细胞，然后把细胞接种于已经处理好的细胞饲养层上，放入细胞培养箱中进行培养，3d换1次细胞培养基。等到细胞长至较密或者细胞团块过大后，加入胰酶进行消化传代，应用差速贴壁法将MEF去除，然后接种到没有饲养层的培养皿中继续进行培养。干细胞培养液(1%的青链霉素、1 000 U/mL LIF、10%的干细胞胎牛血清、高糖DMEM、1%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、0.1%的β-巯基乙醇)

(3)共培养及染色 把聚羟基脂肪酸脂膜剪成圆片状，直径约0.5cm，然后对其进行消毒灭菌，首先放入75%乙醇中浸泡2h，紧接着，放到超净台中用紫外线照射约2h，随后在保持膜表面平整的情况下，贴到96孔板中，加入培养基，浸泡过夜。然后将mESC接种到板中，保持细胞浓度1×104个/mL，与细胞补片共培养，每孔加入干细胞培养基200μL。在细胞培养3d后，固定细胞后制作电镜标本并进行DAPI染色观察细胞生长情况。

(4)向心肌细胞分化 实验分为实验组和对照组，用96孔板培养细胞，每组再细分为四个小组，八个孔为一个小组，编号为组一，二，三，四，组一用PHBHHx膜培养细胞，组二为传统培养皿，组三铺PHBHHx膜，组四为传统培养皿，组一和组二加入含维生素C(0.1mg/L)的分化培养基[5](去除LIF),组三个组四用不添加任何诱导剂的分化培养基培养，每个孔细胞数大约2 000个，细胞培养基200nL，放入培养箱中培养，每天观察细胞分化情况。

(5)心肌细胞的鉴定 加入分化培养基培养15d后，观察细胞形态，发现细胞呈梭形，类似心肌细胞，对细胞进行免疫荧光染色，鉴定心肌特异性标志蛋白cTnT的表达情况。将培养基用吸管吸除，加入PBS清洗3遍以上，加入4%的多聚甲醛，常温固定20min，吸除多聚甲醛后，再加入PBS清洗，不少于3次，每次不少于5min。然后对细胞进行打孔(加入0.1% tritonX-100)，约10min。将上清液吸弃后，加入PBS清洗如上所述，之后加入5%的BSA(牛血清蛋白)，对细胞进行封闭，时间约30min，之后吸弃上清，PBS充分洗涤，加入一抗兔抗鼠心肌肌钙蛋白T，4度过夜，PBS充分清洗后，加入山羊抗兔荧光二抗，避光，孵育45min后，PBS充分洗涤，加入DAPI染色剂，染色30min(避光)，PBS充分洗涤后，加入封片剂，激光共聚焦显微镜下观察。

图1 MEF生长情况 A：第一代MEF；B：第2代MEF；C：第3代MEF

图2 mESC在PHBHHx膜上粘附生长；图3 PHBHHx膜培养细胞增殖明显比传统的培养皿培养要快

(6)心肌细胞标志蛋白cTnT的表达量 小鼠胚胎干细胞诱导分化15天后，吸除培养基，PBS充分洗涤后加入胰酶消化细胞2min，加入培养基终止消化，离心后，吸除上清液，收集细胞，离心5min(1 700r/min)，扣干，加入细胞打孔剂(0.1% tritonX-100),10min后，加入PBS充分洗涤，离心后弃掉上清液，然后加入BSA封闭细胞30min，离心后，吸除上清液，加入一抗，4°过夜后，加入二抗，避光孵育后上机检测。

3.统计学分析 采用SPSS20.0统计学软件进行统计处理。计量资料以均数±标准差表示，计量资料间两组均数比较采用t检验。多组间差异采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)的生长情况 MEF呈贴壁生长，有较大的异质性，大小差别较大，胞质可向外伸出伪足，形成多种形状，如多边形、梭形，哑铃型及不规则的形状，细胞核位于中间，形状类卵圆形。第一代培养的小鼠成纤维细胞含有较多的杂细胞，导致细胞不纯，从而可能影响细胞的活力。通过细胞传代，发现第3代细胞比较纯，细胞活力较强，所以选择其作为饲养层细胞。如图1。

2.mESC与PHBHHx膜共培养DAPI染色 mESC生长迅速，一般培养三天就可以传代，传代之后细胞生长的更加迅速。当成团的细胞长大后，加入消化酶将细胞消化成单细胞，然后加入培养基重悬细胞，计数，然后到PHBHHx膜中进行培养，培养3天后，将细胞固定后，加入DAPI染色剂进行细胞染色，观察细胞的形态，结果如图2所示，mESC与PHBHHx膜粘附良好，细胞生长迅速，形态正常。并通过CCK-8试剂盒测定细胞的活力，观察细胞在膜上的增值情况。如图3所示。

3.扫描电镜观察mESC在PHBHHx膜上的生长粘附状态 在mESC接种到PHBHHx膜上培养3天后，吸弃培养基，PBS洗3遍后，用0.25%戊二醛固定后，制成扫描电镜标本后上机检测，如图4所示。细胞粘附在PHBHHx膜上，生长良好。

图4 扫描电镜图片 A：PHBHHx膜形态(×1000)；B：mESC在PHBHHx膜上生长(×1000)

4.免疫荧光染色 在mESC接种到PHBHHx膜上诱导分化15d后，对其进行心肌细胞特异性标志蛋白-肌钙蛋白(cTnT)进行免疫荧光染色，蛋白发出红色荧光，位于细胞质中，细胞核标记为蓝色，见图5。

图5 免疫莹光染色图 A：不加任何诱导剂组与PHBHHx膜共培养cTnT的表达；B：加维生素C诱导剂组与PHBHHx膜共培养cTnT的表达

5.流式细胞学测定cTnT的表达 在mESC与PHBHHx膜共培养诱导分化15d后，对其进行心肌细胞特异性标志物cTnT进行流式细胞学检测，结果如图6：加维生素C诱导剂组cTnT(47.5±1.5)%>未加任何诱导剂组(7.1±1)%(P<0.05)。对于mESCs向心肌细胞的分化，在添加维生素C诱导剂的情况下，PHBHHx膜细胞培养分化cTnT的表达量(60.3±1.8)%传统的细胞培养皿培养(47.5±1.5)%(P<0.05)。

讨 论

近年来，干细胞移植治疗心肌梗死后心力衰竭是非常新颖的方法，大量的实验证明其在心肌细胞治疗领域的有效性[6]。胚胎干细胞因能够分化为人体所有三胚层细胞，所以成为应用非常广泛的种子细胞[7]。研究者发现通过将胚胎干细胞注入小鼠梗死模型中可以改善小鼠的左心室收缩功能[6]。但是，由于缺少相应的载体，所以在移植治疗过程中会导致细胞大量的流失[8]，导致治疗效果欠佳。所以寻找一种能够模拟细胞外基质的补片材料来为移植细胞提供良好的生存环境是我们迫切需要解决的问题，能够提高干细胞在移植区的存活并促进移植细胞向心肌细胞的分化。

聚羟基脂肪酸脂是组织工程学中常用的材料，近年来发展较为迅速[9]。作为医用材料已经应用到临床的各个方面。PHBHHx作为PHA家族中非常重要的一员，具有非常优良的生物相容性。先前的研究发现PHBHHx可以促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[10]，并且可以和神经干细胞良好的融合并能够促进神经干细胞向神经细胞分化[11]。本实验在此基础上，利用小鼠胚胎干细胞与PHBHHx材料制作的细胞补片共培养，研究PHBHHx材料在治疗心肌梗死方面的潜力。我们发现，PHBHHx膜材料可以与mESC完美融合，mESC可以在PHBHHx膜上粘附生长，且相对于传统的细胞培养皿培养，PHBHHx膜培养更能促进mESC的增殖，培养3天后，我们用CCK-8法测定细胞活力，PHBHHx膜组0D值为(0.726±0.021)，显著高于传统的细胞培养皿培养mESC的OD值(0.312±0.004)，如上图3。之后我们加入诱导分化培养基发现，在不用添加任何诱导剂的情况下，mESCs向心肌细胞分化其肌钙蛋白cTnT的表达量为(8.19±0.88)%，

图6 流式细胞学测定cTnT表达 A:不加任何诱导剂也无PHBHHx膜组cTnT蛋白的表达(8.19%)；B：加维生素C诱导剂但无PHBHHx膜组蛋白cTnT的表达(49.41%)，图示为诱导效率最高的一组；C：不加任何诱导剂与PHBHHx膜共培养心肌细胞特异性蛋白cTnT的表达(12.87%)；D：加诱导剂维生素C与PHBHHx膜共培养心肌细胞cTnT蛋白的表达(53.40%)，图示为诱导效率最高的一组

本研究发现PHBHHx膜与mESC有较好的组织相容性，并且能够促进mESC的增殖和分化,但是需要进一步的动物实验研究补片材料能否改善心肌梗死后的心脏收缩功能。