鹰嘴豆NF-Y基因家族的全基因组序列鉴定及生物信息学分析

滕 露，倪志勇，于月华

(新疆农业大学 农学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

NF-Y(核因子Y，也被称为CBF或血红素激活蛋白)是成员较多的转录因子之一，普遍存在于高等真核生物中，通过结合CCAAT元件参与调节基因表达[1]。NF-Y由3个蛋白质家族的单个亚基组成，即NF-YA亚基(又名HAP2或CBF-B)、NF-YB亚基(HAP3或CBF-A)和NF-YC亚基(HAP5或CBF-C)[2]。这3个亚基在酵母和哺乳动物中均为单基因编码，但在植物中每个亚基都由多个基因编码[3]，这表明在植物中各种蛋白质具有比其他生物更复杂的调节作用机制，每个NF-Y亚基都有自己独特的高度保守的核心区域[4]，帮助植物形成灵活的、多功能的转录因子系统，以适应复杂多样的环境条件[5]。许多研究表明，NF-Y基因家族成员众多，不同成员在植物不同的发育过程中调节相应的生物学功能，如抑制水稻(Oryza)OsHAP3基因的表达导致叶绿体退化，使光合作用相关基因表达量下调[6]。大豆GmNF-YA3在拟南芥中的过表达通过激活脱落酸(ABA)应答基因，增强了拟南芥的抗旱性，提高了对外源ABA的敏感性[7]。杨树PdNF-YB7过表达可以提高转基因拟南芥的耐旱能力[8]。此外，微阵列分析显示，拟南芥AtNF-YA5通过调节多种干旱和氧化诱导型基因改善耐旱性[9]。

目前，很多植物的基因组已经完成了测序，全基因组范围挖掘NF-Y基因家族成员，从进化角度分析NF-Y的功能报道很多。全基因组分析发现，双子叶植物拟南芥中有10个NF-YA基因、13个NF-YB基因和13个NF-YC基因[10]，通过定量PCR发现，2个成员(AtNF-YB9和AtNF-YB6)具有调控植物胚胎发育的功能[11]，AtNF-YB9在植物胚胎发育过程中作为光信号和激素信号的一个调控枢纽起作用[12]。拟南芥的4个NF-YA成员(AtNF-YA1、AtNF-YA5、AtNF-YA6和AtNF-YA9)过表达会影响雄配子及种子的发育[13]。3个表达于维管束的NF-YC成员(AtNF-YC3、AtNF-YC4和AtNF-YC9)参与了光周期依赖性的开花调控过程[14]。全基因组分析发现，大豆中有20个NF-YA、39个NF-YB、27个NF-YC[15]。在单子叶植物水稻中，已鉴定了10个NF-YA基因、11个NF-YB基因和13个NF-YC基因[6]。水稻OsHAP3E通过调控分生组织的形态发生参与到营养生长和生殖发育过程中[16]。水稻的3个NF-YB成员(OsNF-YB2、OsNF-YB3和OsNF-YB4)调控许多光合作用相关的基因[6]。在小麦中已鉴定出10个NF-YA基因、11个NF-YB基因和14个NF-YC基因。小麦中的5个NF-YC成员(TaNF-YC5、TaNF-YC8、TaNF-YC9、TaNF-YC11和TaNF-YC12)受光信号调控[3]。同样，也从大麦、番茄等植物中鉴定出了NF-Y基因家族成员。

鹰嘴豆是一种高营养价值的豆科作物，是第二大食用豆类，富含多种蛋白质、维生素、异黄酮等生理活性物质，具有良好的医疗保健功能，其耐干旱、贫瘠的特点使其成为农作物抗性改良的重要基因资源。目前，鹰嘴豆测序已经完成，为全基因组家族分析提供了序列基础[17]。研究植物基因组中NF-Y基因的分布、基因结构与表达模式，对于进一步研究其在植物生长发育及抗性中的功能具有重要意义[18]。鉴于此，从鹰嘴豆全基因组中查找鉴定可能的NF-Y转录因子家族基因成员，并通过生物信息学分析方法，从序列比对、系统进化树、基因和蛋白质结构、染色体分布以及miRNA的靶位点预测等方面，分析该家族成员的结构和功能，为NF-Y基因的功能研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

鹰嘴豆(Cicerarietinum)全基因组序列下载于NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，拟南芥(Arabidopsisthaliana)的NF-Y基因信息来源于植物转录因子数据库PlantTFDB database(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)。

1.2 NF-Y基因家族成员鉴定

使用拟南芥NF-Y的氨基酸序列进行比对，在鹰嘴豆全基因组序列中鉴定NF-Y基因家族成员，根据在拟南芥中的同源基因，命名鹰嘴豆NF-Y基因家族成员。从NCBI数据库获得各个序列的染色体定位信息，将染色体定位信息整理成表格，利用表格筛选功能，删除全基因组序列中染色体定位相同的基因，去掉重复序列，再通过DNAMAN 8.0软件对NF-Y蛋白氨基酸序列进行分子质量、等电点预测。

1.3 系统发育进化树的构建及蛋白质保守序列比对分析

通过CLUSTALX软件对鹰嘴豆和拟南芥NF-Y蛋白进行多序列比对分析，分析结果使用MEGA 5.0软件，采用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)生成NF-Y蛋白的系统进化树，校验参数Bootstrap重复1 000次。采用DNAMAN 8.0生物学软件进行保守域序列比对分析。

1.4 鹰嘴豆NF-Y基因结构及保守基序分析

根据鹰嘴豆NF-Y基因的cDNA序列，从数据库中得到对应的内含子和外显子长度以及分布信息，利用Gene Structure Display Server(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在线分析鹰嘴豆NF-Y基因家族的基因结构。利用MEME(http://meme-suite.org)在线程序对鹰嘴豆NF-Y基因家族的保守基序进行分析，预测鹰嘴豆NF-Y家族蛋白质的保守基序(Motif)，参数设置为默认值。

1.5 miRNA169的靶位点预测

在psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/)网站中选择靶位点预测栏目，将41条鹰嘴豆NF-Y基因家族成员的基因序列提交至系统进行miRNA169靶位点预测，参数设为默认值。

2 结果与分析

2.1 鹰嘴豆NF-Y基因家族成员鉴定

为了鉴定鹰嘴豆NF-Y基因，使用拟南芥NF-Y的氨基酸序列进行比较，将鹰嘴豆与拟南芥中相似性高的序列作为同系进行命名(表1)。利用MEGA 5.0和DNAMAN 8.0软件，对鹰嘴豆NF-Y基因家族41个成员的氨基酸序列进行分析，发现NF-Y基因家族的41个成员分为8个NF-YA、22个NF-YB和11个NF-YC。根据鹰嘴豆基因位置信息，在7条(Ca1—Ca7)染色体上定位了38个NF-Y基因，1号和4号染色体上基因最多，都含有8个NF-Y成员，其次是7号染色体，含有7个基因，2号染色体上分布最少,另外还有3条序列未定位到染色体上。蛋白质生物信息学分析发现，分子质量最大的是CarNF-YC2蛋白，为104.364 0 ku，最小的是CarNF-YC5蛋白，为12.598 6 ku。鹰嘴豆NF-Y蛋白中CarNF-YC2含有924个氨基酸残基，CarNF-YC5仅有114个氨基酸残基。鹰嘴豆NF-Y基因家族41个成员编码的蛋白质等电点介于4.185 1～10.319 1(表1)。

表1 鹰嘴豆NF-Y基因家族成员信息

续表1 鹰嘴豆NF-Y基因家族成员信息

2.2 鹰嘴豆NF-Y家族基因结构、保守基序及系统进化分析

为了解鹰嘴豆41个NF-Y基因系统进化关系以及生物学功能，构建鹰嘴豆与拟南芥NF-Y蛋白家族成员进化树(图1)。由图1可见，Car/AtNF-YA可以分成6类(Ⅰ—Ⅵ)，分别由6、1、3、3、1、4种蛋白质组成；Car/AtNF-YB可以分成4类(Ⅰ—Ⅳ)，分别由21、8、2、4种蛋白质组成；Car/AtNF-YC亚基可以分成3类(Ⅰ—Ⅲ)，分别由17、4、4个蛋白质组成(图1)。

鹰嘴豆NF-Y基因基序鉴定结果(图2)显示，共鉴定到3个保守基序，分别为Motif1、Motif2和Motif3，其中Motif1、Motif2在CarNF-YB和CarNF-YC亚家族中均有分布，而Motif3仅分布在CarNF-YA亚家族中。同一分类的NF-Y转录因子基本上含有相同的保守基序。对鹰嘴豆NF-Y家族成员的基因结构进行分析，结果显示，NF-Y基因家族成员大部分由1～5个内含子和1～6个外显子组成，其中18个成员只有1个外显子，外显子比较长的是CarNF-YC2和CarNF-YC3，分别为1 660 bp和782 bp，少数序列如CarNF-YB9和CarNF-YC6等仅含有外显子结构(图2)。

A、B、C分别为Car/AtNF-YA、Car/AtNF-YB、Car/AtNF-YC亚家族系统进化树

2.3 鹰嘴豆NF-Y保守域序列比对分析

使用全长氨基酸序列进行多序列比对，鉴定鹰嘴豆NF-Y 3个亚基家族的结构域，CarNF-YA蛋白具有1个NF-YB/NF-YC亚基相互作用结构域和1个DNA结合结构域。CarNF-YB蛋白包括2个NF-YC相互作用结构域、1个NF-YA相互作用结构域和1个DNA结合结构域。CarNF-YC蛋白包括2个NF-YA相互作用结构域、2个NF-YB相互作用结构域和1个DNA结合结构域(图3—5)。

2.4 miRNA169的靶位点预测

通过psRNATarget网站在线预测鹰嘴豆NF-Y基因家族的miRNA169靶位点，结果显示，只有NF-YA基因亚家族的成员中有6个CarNF-YA(CarNF-YA1/2/3/4/5/7)受miRNA169调控(图6)，而NF-YB、NF-YC亚家族基因没有该靶位点。

左为CarNF-Y基因家族进化树，中为CarNF-Y基因结构，右为CarNF-Y保守基序

图3 鹰嘴豆NF-Y家族中CarNF-YA蛋白保守域序列比对

图4 鹰嘴豆NF-Y家族中CarNF-YB蛋白保守域序列比对

图5 鹰嘴豆NF-Y家族中CarNF-YC蛋白保守域序列比对分析

图6 CarNF-YA基因3′非翻译区推测的miRNA169靶位点

3 结论与讨论

NF-Y转录因子功能多样，它们参与调节植物胚胎发育、光合作用、叶绿体发育和逆境响应等重要生理过程。本研究通过对鹰嘴豆进行全基因组生物信息学分析，共鉴定出41个鹰嘴豆NF-Y蛋白家族成员，包括8个NF-YA、22个NF-YB和11个NF-YC。系统进化树上位于一个分支的蛋白质可能具有类似的生物学功能，之前的研究已经鉴定了一些拟南芥NF-Y蛋白家族成员的生物学功能，如拟南芥NF-YA能够抑制活性氧的积累从而激活ABA途径的基因表达[19]。本研究利用模式植物拟南芥的NF-Y基因进行同源比对分析，构建了鹰嘴豆和拟南芥NF-Y蛋白家族成员进化树，发现Car/AtNF-YA、Car/AtNF-YB和Car/AtNF-YC这3个亚家族各个成员在进化树上均表现出相近的亲缘关系。Car/AtNF-YA可以分成6类，分别由6、1、3、3、1、4种蛋白质组成；Car/AtNF-YB可以分成4类，分别由21、8、2、4种蛋白质组成；Car/AtNF-YC亚基可以分成3类，分别由17、4、4个蛋白质组成，据此可预测鹰嘴豆NF-Y转录因子的生物学功能，为深入研究NF-Y转录因子家族的生物学功能提供了基础理论依据。

miRNA通过识别靶mRNA互补位点，切割靶mRNA或抑制其翻译，调控基因的表达。研究表明，NF-YA亚基的编码基因在转录后水平受miRNA169调控。例如，拟南芥AtNF-YA5受miRNA169负调控应答干旱胁迫[9]，水稻miRNA169切割OsNF-YA8参与盐胁迫应答[20]。本研究通过miRNA靶位点预测，发现6个CarNF-YA(CarNF-YA1/2/3/4/5/7)受miRNA169调控，而CarNF-YB和CarNF-YC不受miRNA调控，暗示NF-YA基因可能存在更复杂的调控机制。