转基因实验的设计和流程简述

2018-10-31沈兆瑞

生物学教学 2018年10期

沈兆瑞

(天津市武清区杨村第一中学天津 301700)

1 教材分析

“基因工程”是人教版高中生物学教材中(必修2)第六章以及(选修3)专题一的内容，主要是围绕着转基因实验的基本操作程序展开：包括“目的基因的获取”“基因表达载体的构建”“将目的基因导入受体细胞”和“目的基因的检测与鉴定”。转基因实验的流程繁琐且远离日常生活，以至于学生对上述步骤的认知常停留在记忆层面。因此，教材中建议“有条件的地方，尝试让部分学生参与转基因实验并介绍给其他学生”。本文以此为出发点，带领学生设计并开展一次完整的转基因实验，并以讲座形式进行流程简述，以深化学生对教材知识的理解及应用。

2 实验设计

2.1 受体植株的选择——拟南芥拟南芥(Arabidopsisthaliana)属十字花科植物，在中国的华东、中南和西北等地广泛分布，一般生长于山坡、平地、河边以及路边。由于具备生长周期短、繁殖系数高和基因组小等优点，因此被作为模式生物广泛应用于分子生物学、遗传学和发育生物学等领域中[1]。

2.2 目的基因以及相关元件的选择具体如下：

(1) 目的基因选取绿色荧光蛋白(GFP)基因作为目的基因，并在其上游连接一段的信号肽序列(signal peptide，简称sp)，后者可帮助GFP定位于线粒体中，方便后续的检测与鉴定。

(2) 启动子选择在双子叶植物中广泛使用的组成型启动子CaMV 35S，用于驱动目的基因的高效表达。

3 实验步骤

3.1 构建重组质粒具体如下：

(1) 构建基因表达载体利用工具酶，依次将启动子、信号肽序列和目的基因连接成一段DNA序列(图1A所示)，其上下游分别携带BamH I与KpnI酶切位点，方便与普通质粒(图1B所示)重组。利用双酶切法同时处理目的基因与普通质粒，连接后获得重组质粒(图1C所示)。

(2) 转化将上述连接产物导入处于“感受态”的大肠杆菌中，所得的转化产物主要分为三类：绝大多数为空白的感受态细胞，少数细胞成功导入重组质粒。除此之外，还存在普通质粒自连所造成的干扰。

(3) 抗性筛选将转化产物转移至含有氨苄青霉素(Amp)的培养基中进行初步筛选，得到含有标记基因的大肠杆菌单克隆菌落。

(4) PCR鉴定为了进一步排除普通质粒的干扰，利用多聚酶链式反应(PCR)技术对目的基因进行检测。通过DNA凝胶电泳观察显示，除去4/7/8组外，其余各组均获得扩增条带，表明成功导入重组质粒(如图1，D所示)。

(5) 提取质粒任取一组成功导入重组质粒的单克隆菌落进行二次扩培，提取重组质粒备用。

图1 构建重组质粒

3.2 将目的基因导入受体细胞农杆菌侵染作为一种天然的植物转化体系，在双子叶植物的应用中尤为常见。农杆菌细胞质中的Ti质粒内含一段T-DNA序列，侵入植物体后，该序列会随机插入植物细胞的染色体组中，产生可遗传变异。将重组质粒导入农杆菌“感受态”细胞中，经过转化、抗性筛选、PCR鉴定等步骤(同上文，不作赘述)获取携带重组质粒的农杆菌，在28℃下扩培后备用。

本实验采取花序浸泡法，让携带目的基因的农杆菌侵染拟南芥子房内部的胚珠(将发育成种子)，使子代获得相应性状。选取生长状态良好的拟南芥植株，待花序发育至适宜阶段后，剪除已成熟角果与已授粉花，并在24h后进行转化。在此期间，将二次扩培的农杆菌与等渗溶液(常用蔗糖溶液)混匀，制备农杆菌悬浊液备用。将经过剪切后的花序浸泡入上述悬浊液中，带有T-DNA序列的农杆菌通过侵染进入植株体内并完成转化。对转化后植株进行避光和密闭保湿处理，24h后解除并移至适宜环境下生长。

3.3 目的基因的检测与鉴定一般将农杆菌侵染的植株命名为T0代，其子代多数为正常植株(未成功转化)，少数转化成功的植株被命名为T1代。花序浸泡法操作简便，但转化效率相对偏低。因此，必须利用抗性筛选来获取成功导入目的基因的T1代。因为本实验选取的农杆菌携带潮霉素抗性基因，所以使用含有潮霉素的植物生长培养基对T0代的种子进行筛选。潮霉素对幼苗生长有明显抑制作用，仅有成功导入农杆菌的T1代幼苗能够正常生长发育。

绿色荧光蛋白(GFP)受到蓝光照射时，会吸收能量并激发出绿色荧光。依据该特性，GFP常被生物学家作为标记蛋白，用于观察细胞内蛋白分子的动态变化[2]。本实验可通过观察T1代幼苗的绿色荧光水平，来进一步检测与鉴定目的基因的表达情况。检测结果表明，在拟南芥幼苗的根、茎和叶中均能检测到绿色荧光信号。进一步通过酶解处理，获取单个原生质体后在显微镜下观察，发现GFP集中分布于线粒体中。上述结果均表明目的基因成功导入了T1代幼苗中并正确表达，该幼苗确为转基因植株，本次转基因实验流程完成。