CD40对晚期上皮性卵巢癌新辅助化疗敏感性的预测价值

陈晓晴　刘玉玲

[摘要]目的 通过检测卵巢癌组织中的CD40表达水平，判断新辅助化疗（NACT）对卵巢癌中CD40分子表达的影响，从而进一步推断CD40分子是否可以作为预测卵巢癌化疗敏感性的生物学标志。方法 选取2015年12月～2017年12月在我院就诊的晚期上皮性卵巢癌患者80例，根据术前有无进行NACT，分为行NACT者30例，为A组，未行NACT者50例，为B组，对应的卵巢癌组织术后病理石蜡切块分别为30枚和50枚。采用免疫组织化学方法检测两组卵巢癌组织中的CD40分子表达水平。结果 A组的化疗总有效率（80.00%）明显高于B组（58.00%），差异有统计学意义（P<0.05）。A组的CD40阳性表达率（56.67%）低于B组（80.00%），差异有统计学意义（P<0.05）；A组中化疗有效者CD40的阳性表达率（45.83%）明显低于化疗无效者（100.00%），差异有统计学意义（P<0.05）。CD40在晚期卵巢癌中的表达与Ki-67成正相关（r=0.539，P=0.000）。结论 CD40在晚期卵巢癌NACT者和未行NACT中的表达差异显著。CD40可以作为预测新辅助化疗敏感性的生物学标志物，有助于指导NACT在晚期卵巢癌中的应用。

[关键词]卵巢癌；新辅助化疗；CD40；Ki-67；免疫组织化学

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）6（c）-0017-04

[Abstract]Objective To determine the influence of neoadjuvant chemotherapy （NACT） on the expression of CD40 in ovarian cancer，and further infer whether the CD40 molecule can be used as a biological marker to predict the chemosensitivity of ovarian cancer by examining the expression of CD40 in ovarian cancer tissue.Methods Eighty patients with advanced epithelial ovarian cancer treated in our hospital from December 2015 to December 2017 were selected and they were classified into group A （n=30） given NACT and group B （n=50） without NACT according to whether they performed neoadjuvant chemotherapy before surgery or not.The corresponding paraffin sections of ovarian cancer tissues were 30 and 50 respectively.Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD40 in two groups of ovarian cancer tissue.Results The total effective rate of chemotherapy in group A （80.00%） was significantly higher than that of group B （58.00%），and the difference was statistically significant （P<0.05）.The positive expression rate of CD40 in group A （56.67%） was lower than that of group B （80.00%），and the difference was statistically significant （P<0.05）.The positive expression rate of CD40 in chemo effective patients （45.83%） was significantly lower than that in chemo ineffective patients （100.00%） of group A，and the difference was statistically significant （P<0.05）.The expression of CD40 in advanced ovarian cancer was positively correlated with Ki-67 （r=0.539，P=0.000）.Conclusion The expression of CD40 was significantly different between NACT and NACT of advanced ovarian cancer.CD40 can be used as a biomarker for predicting the sensitivity of NACT，and it helps to guide the application of NACT in advanced ovarian cancer.

[Key words]Ovarian cancer；Neoadjuvant chemotherapy；CD40；Ki-67；Immunohistochemistry

卵巢癌是女性生殖道最常見的三大恶性肿瘤之一，其病死率在妇科肿瘤中居首位[1]。现阶段卵巢癌主要采用手术+铂类化疗方案，对于不能直接进行手术治疗的患者，采用新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy，NACT）。但是目前NACT的应用缺乏更加规范化、个体化的治疗标准，且导致卵巢癌生物学行为的分子机制尚不明确。

CD40是具有48-50KD的Ⅰ型跨膜糖蛋白[2-3]。研究表明CD40除了广泛表达于B细胞、上皮细胞、内皮细胞等外，在浸润性乳腺导管癌、宫颈癌及弥漫大B细胞淋巴瘤等肿瘤组织中也呈高表达。

目前对于CD40在卵巢癌中表达的研究较少，尤其是CD40对NACT的敏感性，故本课题现对行NACT者及未行NACT者，通过免疫组织化学方法检测两组行NACT后和未行NACT卵巢癌组织中的CD40表达水平，通过Ki-67来量化CD40与晚期卵巢癌NACT敏感性的关系，判断NACT对卵巢癌中CD40分子表达的影响，从而进一步推断CD40分子是否可以作为预测卵巢癌化疗敏感性的生物学标志。

1资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年12月～2017年12月在我院就诊的80例晚期卵巢癌患者，其中行NACT联合间歇性肿瘤细胞减灭术者30例，为A组，年龄为44～73岁，平均53岁；未行NACT而行初始肿瘤细胞减灭术者50例，为B组，年龄为41～69岁，平均50岁。实验对象：采用免疫组织化学方法检测NACT者晚期卵巢癌术后病理石蜡块标本30枚、行初始肿瘤细胞减灭术晚期卵巢癌病理石蜡块标本50枚。

1.2 纳入标准、排除标准

纳入标准：①所有患者入院前未进行任何治疗；②A组术前影像学检查显示大量腹腔积液、盆腔包块、腹膜转移；③A组术前血清CA125>1000 U/ml；④A组术前均行1～3个周期的化疗；⑤A组术前均通过影像学检查、超声引导下穿刺引流，并且术后确诊为晚期上皮性卵巢癌者；⑥所有研究对象临床资料完整，且签署知情同意书。所有行NACT的患者均按照最新《NCCN指南》中的标准NACT紫杉醇+铂类（TP）方案进行。所有入组患者均行理想的肿瘤细胞减灭术。实验中涉及的受试者权益和伦理学均符合有关规定。排除标准：①无术后明确病理诊断者；②合并其他恶性肿瘤者；③术前评估不能耐受该手术者。

1.3 疗效评价标准

完全缓解（CR）：所有病灶消失，且CA125≤35 U/ml；部分缓解（PR）：靶病灶最大直径之和减少>30%，CA125>35 U/ml或者CA125下降最初高值的50%；疾病稳定（SD）：靶病灶最大直径之和减少30%或者增加病灶未达病情进展（PD），或CA125值未见明显增高；PD：靶病灶最大直径之和增加>20%，出现新的病灶，或者CA125值升高至正常水平的2倍以上。化疗缓解=部分缓解+完全缓解。

1.4 实验主要试剂和方法

鼠抗人CD40单克隆抗体（H-10）：13128购自圣克鲁斯生物技术有限公司；鼠抗人Ki-67单克隆抗体购自基因科技（上海）有限公司。采用免疫组织化学SP染色法。实验步骤：①将石蜡标本进行连续切片，在78℃烤箱进行烤片1 h；②脱蜡：二甲苯中进行脱蜡5～10 min，用PBS（pH=7.4）反复冲洗；③抗原修复：在盛有柠檬酸盐修复液（pH=6.0）的高压锅中，进行抗原修复，PBS冲洗3 min×3次；④阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3 min×3次；⑤将1滴（约50 μl）第一抗体滴加在每张切片中，CD40和Ki-67抗体的工作浓度为1∶100，放入4℃冰箱中过夜；⑥加入反应增强液，室温下孵育20 min；⑦将1滴（50 μl）二抗即酶标抗鼠聚合物滴加在每张切片中，在室温下孵育50 min后去除PBS液；⑧滴加DAB显色剂进行显色，显微镜下观察染色效果；⑨终止显色，进行复染、分化，自来水反复冲洗，PBS冲洗；⑩用梯度乙醇进行脱水干燥，使用二甲苯透明及中性树胶封片。操作步骤严格按照SP试剂盒说明书进行，以提供的阳性对照片作为阳性对照，阴性对照片除用PBS代替一抗外，其余步骤相同。

1.5结果判定

所有的CD40和Ki-67的切片均由病理科两位高年资医生对结果进行判定。CD40染色阳性为棕黄色，主要存在于细胞膜上，胞质着色亦为阳性。Ki-67主要定位于细胞核，胞质、胞核同时呈棕黄色亦为阳性。每张切片随机观察10个高倍视野（10×40），每个视野取100个细胞，记分标准参照免疫反应计分法（immuno reactive score，IRS） 基于3个参数的半定量记数方法：染色强度评分以无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞所占比例评分以阳性细胞数≤25%为0分，25%～50% 为1分，50%～75% 为2分，>75%为3分；每例最后得分为A项×B项：0分为阴性，1分为弱阳性（+），2～3 分为阳性（++），>3分为强阳性（+++） 。

1.6 统计学方法

数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，相关性分析采用Spearman等级相关检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 晚期卵巢癌不同化疗时机的临床疗效的比较

A组化疗总有效率为 80.00%，B组为58.00%，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.2 A、B组中CD40阳性表达率的比较

A组的CD40阳性表达率为56.67%，B組为80.00%，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

2.3 NACT者中不同临床疗效组CD40阳性表达率的比较

A组中化疗有效组CD40的阳性表达率为45.83%，无效组阳性率为100.00%，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

2.4 CD40与Ki-67在晚期卵巢癌中表达的相关性

CD40 与 Ki-67在晚期卵巢癌中的表达成正相关（r=0.539，P=0.000）（表4）。

3 讨论

肿瘤的发生、发展是一个多基因的复杂过程。卵巢癌的发生机制尚不明确，且生存率较低尤其是晚期卵巢癌患者。对于巨块型的卵巢癌患者或者直接失去手术时机的晚期卵巢癌患者，因为其淋巴结转移及脉管侵犯早，或者远处转移风险较高，单纯手术治疗不能取得满意的治疗效果。近年来，有学者提出在术前应用NACT，应用于晚期卵巢癌。虽然目前的研究结果显示NACT可以提高卵巢癌患者的生存质量，减少肿瘤复发[4]，并且有文献指出NACT联合中间性肿瘤细胞减灭术对晚期卵巢癌的治疗有效[5-7]，但是寻找预测NACT敏感性的指标尤为重要。

CD40位于20号染色体上，是由8个内含子和9个外显子组成的长臂[8]。CD40可以在B细胞、单核巨噬细胞等细胞中表达，但是正常组织中检测含量较少。有研究表明，CD40分子可以促进恶性肿瘤细胞的增殖作用[9]。CD40的配体为CD40L，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白。CD40和CD40L的特异性结合是CD40介导的信号转导的重要步骤。CD40介导的信号转导可以诱导T、B细胞活化，产生细胞因子，参与自身免疫性疾病的发病过程[10-11]。随着越来越多的研究证明，CD40分子与上皮性肿瘤的分化、浸润转移有关，与肿瘤血管形成也有关[12]。CD40与单核细胞表面受体结合从而诱导基质释放金属蛋白酶，从而使肿瘤细胞转移侵袭[13]。另有研究表明，CD40分子可以促进恶性肿瘤细胞的增殖作用[14]。主要是因为恶性肿瘤细胞表达少或者不表达免疫原性细胞克隆产物，所以可以逃离免疫细胞的识别和监视。CD40分子是免疫细胞与肿瘤细胞的“中介”，通过产生一系列的反应，在这两种细胞间传递信息，发挥作用。CD40成为现在研究肿瘤发生机制及肿瘤治疗中的研究热点。

本研究结果显示，晚期卵巢癌NACT者CD40阳性表达率低于未行NACT者（P<0.05）。本研究只是研究晚期卵巢癌，对CD40的阳性表达是否与肿瘤分期未作研究，但是在黄沁等[15]的研究中指出临床分期与CD40分子的表达无明显相关性（P>0.05）。黄建安等[16]的研究指出，CD40分子的表达与临床分期、淋巴结转移明显相关（P<0.05）。故CD40分子的表达与临床分期的关系还不明确，需要更多的研究来证实。但是根据本研究结果NACT可以降低CD40在晚期卵巢癌中的表达，提示CD40对NACT有敏感性。

本研究中在NACT有效组中CD40的阳性表达率低于无效组（P<0.05），提示在NACT组有效者中CD40表达下降。结合本研究中NACT者中CD40分子阳性率低于未行NACT者CD40分子阳性率，推测可能是因为化疗药物主要是作用于增殖中的细胞使得细胞周期停滞，从而使细胞凋亡，而CD40与CD40L连接使细胞周期阻滞在G2/M期，化疗药物的作用和CD40与CD40L的作用类似，有可能是化疗药物与CD40信号产生的“协同作用”，从而产生更好的治疗效果。这与Yahara等[17]研究的CD40与CD40L结合可以提高肿瘤细胞对辅助化疗的敏感性的结论相似，提示CD40分子可以作为预测NACT敏感性的肿瘤标志物，并且CD40与CD40L的结合可以抑制肿瘤细胞的生长和引导细胞周期的停滞，并在一定程度上可诱导敏感细胞的凋亡，从而成为肿瘤治疗研究新的热点。

Ki-67核抗原是存在于增殖细胞中的相关性抗原。它在增生活跃的细胞中普遍表达，但是在“静止”细胞中表达不明显或者不表达，并且在细胞的周期的各个阶段都有表达，除外有丝分裂G0期，正是因为这种特别的生物学特征使Ki-67成为可以反映肿瘤细胞增殖活性的非常可靠的生物标志物。Ki-67在肿瘤组织中的表达含量越高，表明肿瘤细胞的增殖活性越高。化疗药物也正是作用于这种增殖活跃的癌细胞，其具有最强的致死性并且能够快速的诱导细胞凋亡，表明Ki-67与肿瘤对化疗的敏感性有关。Ki-67能更好地反映增殖活跃的细胞的数量，过度的表达常促使细胞增生，对恶性和良性肿瘤的鉴别有一定意义[18]。

Ki-67已经应用于多种恶性肿瘤细胞的鉴别中，如有研究指出在口腔鳞状细胞癌中术前应用NACT后Ki-67阳性率下降，认为可以抑制肿瘤细胞的增殖。Qin等[19]、Wu等[20]也分别分析了乳腺癌、胃癌患者NACT后Ki-67阳性率明显下降，证实了Ki-67与预测NACT的敏感性有关。

本研究中CD40与Ki-67共表达的分析表明两者表达成正相关（r=0.539，P=0.000）。CD40与Ki-67的表达存在一定的“协同作用”，提示Ki-67高表达者，化疗有效率高，对化疗敏感；同时CD40也存在高表达者，化疗有效，这也是从另一方面证实CD40可以预测晚期卵巢癌NACT敏感性。在临床中Ki-67已经被用来检测卵巢癌的恶性程度，根据Ki-67与CD40的“协同作用”，联合检测晚期卵巢癌患者中CD40和Ki-67的表达情况，对于预测晚期卵巢癌NACT的敏感性及检测卵巢癌的恶性程度具有重要的临床意义。

综上所述，CD40和Ki-67分子在卵巢癌的中的异常表达对卵巢癌的发生、发展有重要意义，并且两者存在协同作用，两者在预测卵巢癌NACT的敏感性有重要意义，但是对于CD40在卵巢癌中的作用机制需要更进一步的研究，也许不久的将来CD40分子也可以作为治疗卵巢癌的靶分子应用到卵巢癌的治疗中。

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（收稿日期：2018-04-08 本文编辑：许俊琴）