环孢素A对高糖状态下七氟醚后处理大鼠心肌细胞保护作用的影响

俞 瑾, 詹海婷, 程 虎, 李玉倩, 郑 宏

(新疆医科大学第一附属医院麻醉科, 乌鲁木齐830054

与非糖尿病患者相比，高糖增加了糖尿病患者急性心肌梗死后的死亡率[1]。七氟醚后处理(Sevoflurane postcondition，SPostC)作为吸入麻醉剂后处理的典型代表，已被证实具有良好的抗缺血/再灌注损伤(IRI)保护作用。然而糖尿病状态下，SPostC心肌保护作用失活[2-5]。

心肌IRI中，线粒体既是触发器也是效应器，其功能状态直接决定细胞存亡[6,7]。作为动态变化的细胞器，心肌细胞线粒体不断地通过融合与分裂改变其形态以适应内环境的需要[8]。线粒体膜通透性转换孔( mitochondrial permeability transition pore，mPTP) 的开放程度在IRI中扮演着重要角色[9]。环孢素A(cyclosporin A，CsA)作为经典的mPTP 开放抑制剂，已经被证实可以有效地拮抗心肌IRI。然而，尚不清楚CsA能否通过抑制mPTP开放，并维持线粒体形态恢复SPostC对高糖培养细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

清洁级1～3 日龄SD乳鼠, 购自新疆医科大学动物实验中心[SCXK(新)2016-0003], 实验在新疆医科大学第一附属医院动物实验中心完成[SYXK(新)2015-0002]。主要试剂有DMEM培养基(低糖/高糖)、0.25%胰酶消化液、胎牛血清(美国HyClone公司); 青霉素-链霉素溶液(中国Solarbio公司); 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU，美国Sigma公司); 乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(中国南京建成公司); TUNEL检测试剂盒(瑞士Roche公司); 线粒体示踪荧光探针(美国Invitrogen公司); 四甲基罗丹明甲脂(TMRM)(MitoPT®TMRM Assay Kit, No.9105，美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 心肌细胞培养

1～3日龄SD乳鼠, 消毒后无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的4 ℃ PBS溶液洗涤3遍, 去除血管、心包和心房, 重复清洗3次将心脏剪成约1 mm3小块; 加入5倍体积的质量分数0.125%胰酶在37 ℃恒温消化心肌组织，第1次消化8 min后自然沉淀并弃上清, 以后自然沉淀后留取上清; 每次分离的上清液加等量含体积分数10 %胎牛血清的DMEM低糖培养液, 轻轻吹打混匀以终止消化; 重复消化过程4～6次直至消化完全，合并所得细胞悬液, 200目钢网过滤, 过滤液常温下离心(1 000 r/min, 5 min), 沉淀物即为乳鼠心肌细胞。将乳鼠心肌细胞用含体积分数10%胎牛血清的DMEM低糖培养基重悬、混匀,接种于10 mm培养皿中, 置入37℃、体积分数5%CO2+95% 空气的恒温细胞培养箱差速贴壁120 min后，吸取上清液即为纯化后的乳鼠心肌细胞，调整细胞浓度为5.0×105细胞/ mL，将单细胞悬液接种于培养皿中, 培养24 h。培养24 h后换液，前3 d加入终浓度0.1 mmol/L的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brdu)，以抑制成纤维细胞的增殖，并继续培养。刚贴壁24 h内尽量避免移动培养皿。原代乳鼠心肌细胞鉴定采用cTnI 标记免疫荧光法，锥虫兰(台盼蓝)拒染实验测定细胞存活率。

1.3 实验分组及处理

如图1所示。① 缺氧/复氧(H/R)组： 细胞贴壁24 h后继续低糖培养48 h。缺氧3 h, 复氧 3 h。将细胞培养皿内培养基弃去，PBS冲洗3次，加入适量PBS溶液，将细胞置于体积分数95%氮气，体积分数5%CO2的三气培养箱中, 37 ℃培养3 h, 实施氧糖剥夺。将经过缺氧的细胞取出, PBS快速冲洗3次, 加入含有质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基, 置于37 ℃、体积分数95%空气、体积分数5%CO2培养箱中继续培养3 h。② SPostC组：细胞贴壁24 h后继续低糖培养48 h。缺氧3 h, 复氧3 h。缺氧3 h后, 将经过缺氧的细胞取出，PBS快速冲洗3次, 加入含有质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基, 置于37℃, 体积分数97.6% O2-2.4%七氟醚混合气体密闭容器内培养15 min，然后继续置于37 ℃, 95%空气, 体积分数5%CO2培养箱中继续培养至复氧满3 h。③ CsA组： 在缺氧前10 min给予CsA终浓度0.2 μmol/L, 其余同H/R组。④SPostC+CsA组： 在缺氧前10 min给予CsA终浓度0.2 μmol/L，其余同SPostC组。⑤ 高糖(HG)组：细胞贴壁24 h后高糖(35 mmol/L)培养48 h。缺氧3 h, 复氧 3 h。将细胞培养皿内培养基弃去，PBS冲洗3次，加入适量PBS溶液, 将细胞置于体积分数95%氮气, 体积分数5%CO2的细胞缺氧盒内, 37℃培养3 h，实施氧糖剥夺。将经过缺氧的细胞取出, PBS快速冲洗3次, 加入含有质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基, 置于37℃, 体积分数95%空气，体积分数5%CO2培养箱中继续培养3 h。⑥HG+SPostC 组： 细胞贴壁24 h后高糖(35 mmol/L)培养48 h, 其余同SPostC组。⑦ HG+CsA组： 在缺氧前10 min给予CsA终浓度0.2 μmol/L, 其余同HG组。⑧ HG+ SPostC+CsA组： 在缺氧前10 min给予CsA终浓度 0.2 μmol/L, 其余同HG+SPostC组。

1.4 测定指标

1.4.1 LDH测定 每组独立采样6次, 吸取0.1 mL培养基, 按照LDH检测试剂盒(南京建成生物工程研究所, A020-2)说明, 使用酶标仪比色法检测LDH含量。

1.4.2 细胞凋亡检测 使用罗氏TUNEL检测试剂盒(RocheIn Situ Cell Death Detection Kit，POD，11684817910)，按照说明染色后在荧光显微镜下拍照计数。TUNEL染色激发光波长为450～500 nm, 检测波长为515～565 nm, DAPI吸收波长358 nm, 最大发射波长461 nm; 每组10倍镜下随机选取10个视野用于计数，独立重复3次。

1.4.3 线粒体形态观察 干预结束后加入终浓度为200 nmol/L的线粒体示踪荧光探针，37 ℃避光孵育30 min，激光共聚焦显微镜(激发波长480 nm，散发波长527 nm)观察带有绿色荧光的心肌细胞线粒体形态。应用Image J软件对线粒体形态进行定量分析[9]。线粒体连接度通过平均面积/周长比值来反映，比值越大，说明线粒体连接度越高，网络化程度越明显。每组随机选取30个细胞计算。

1.4.4 线粒体膜电位测定 加入终浓度为20 nmol/L的TMRM，37 ℃避光孵育10 min，PBS冲洗3次后使用共聚焦显微镜(激发波长548 nm，散发波长559 nm)与Image J软件对荧光强度进行定量检测，每组随机选取30个细胞计算。

图 1 实验分组图

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad Software,San Diego, CA)。对所有数据进行统计学分析。资料以均数±标准误表示, 多组间比较采用ANOVA单因素方差分析，两两相互比较时采用Tukey’s多重比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞鉴定

所获得的原代乳鼠心肌细胞采用cTnI 标记免疫荧光鉴定心肌细胞纯度达90.5%，台盼蓝拒染试验测定第3日细胞存活率为92.15%±1.63%。

2.2 H/R损伤后的LDH水平与细胞死亡率(TUNEL

阳性细胞百分比)的变化

SPostC与CsA均降低了H/R损伤后的LDH水平与细胞死亡率(P＜0.05)，二者联合并未进一步增强保护作用。高糖增加了心肌细胞H/R损伤后的LDH水平与细胞死亡率(P＜0.05)。高糖浓度下，上述保护作用均消失，与HG组相比，SPostC、CsA及二者联合均未能降低H/R损伤后的LDH水平与细胞死亡率(P＞0.05)(图 2A、2B)。

2.3 心肌细胞线粒体形态(平均面积/周长)变化

正常情况下, 原代乳鼠心肌细胞线粒体相互连接, 呈丝网状。H/R损伤后, 线粒体分裂增多, 呈点块状，SPostC与CsA均调节了线粒体形态，使其恢复为丝网状连接。采用Image J软件线粒体形态分析插件定量分析线粒体连接度(平均面积/周长)，结果表明, SPostC与CsA均增加了H/R损伤后的平均面积/周长比(P＜0.05)，二者联合并未进一步增强该作用。高糖进一步降低了原代心肌细胞H/R损伤后的平均面积/周长比(P＜0.05)。高糖时SPostC对线粒体连接度作用消失，CsA并未能恢复该作用(P＞0.05)(图 2C、2E)。

2.4 心肌细胞线粒体膜电位(TMRM荧光强度)变化

H/R损伤后线粒体红色荧光强度减弱，线粒体膜电位降低。SPostC与CsA均增加了H/R损伤后的红色荧光强度(P＜0.05), 二者联合并未进一步增强荧光强度。高糖进一步降低了原代心肌细胞H/R损伤后的线粒体膜电位水平(P＜0.05)。高糖时SPostC维持线粒体膜电位作用消失，CsA联合SPostC并未能增加红色荧光强度(P＞0.05)(图2D、2F)。

图 2 细胞死亡率、线粒体形态及膜电位变化

3 讨论

SPostC可产生类似H/R预处理的心肌保护作用, 且已经证实对于年轻健康的心肌所发生的IRI具有良好的保护效果，是极具希望的抗心肌损伤治疗手段[10-13]。研究表明[14-16], SPostC通过RISK信号通路转导途径PI3K/AKT/mTOR、ERK1/2、GSK-3β等, 调控凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bad等, 从而阻断mPTP的开放, 避免线粒体膜电位坍塌, 促进氧化磷酸化耦联, 增加ATP生成起到心肌保护作用。然而，糖尿病状态下, SPostC心肌保护效果缺失或弱化[3-5], 并且使用胰岛素使糖尿病大鼠血糖水平正常后仍不能恢复SPostC 的心肌保护作用[17]，这无疑严重制约了SPostC在心肌保护中的推广应用。

CsA 为亲脂性的含有11 个氨基酸的环形肽, 其通过抑制钙调磷酸酶阻止激活T细胞转录因子的核物质进入细胞核, 从而抑制T细胞激活基因的表达,在临床上广泛用于治疗自身免疫性疾病和器官移植后抗免疫排斥反应。然而除免疫抑制作用外, 在基础研究中CsA被广泛应用于抑制mPTP 的开放[18]。CsA 通过与线粒体基质的环孢菌素受体(cyclophilin D，Cyp-D) 特异性结合，阻止mPTP 开放，从而抑制细胞凋亡。

mPTP 作为线粒体膜上的一种非特异性通道，由外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage dependentanion channel, VDAC) 、内膜的腺嘌呤核苷酸转运体(adenine nucleotide translocator, ANT) 、Cyp-D、线粒体ATP合酶及线粒体磷载体(mitochondrial phosphate carrier, PiC)组成[19]。生理状态下, 线粒体内膜对离子和代谢物质无通透性。心肌缺血期时, mPTP处于关闭状态, 而在再灌注时, 由于基质的Ca2+超载和ROS的产生使得mPTP开放。mPTP 开放导致线粒体膜对小分子物质(相对分子质量＜1 500)的通透性升高，造成线粒体膜电位去极化、呼吸链解耦联、细胞色素C漏出，最终激活caspases凋亡级联反应和其他凋亡因子。严重损伤时ATP耗竭，过多水分进入线粒体基质致其肿胀而后破裂，出现caspase 依赖与非依赖的级联反应，导致细胞死亡[19]。前期大量研究[18,20-24]证实，CsA通过抑制mPTP具有抗心肌IRI保护效应。

综合以上研究结果表明, SPostC通过激活生存信号通路，最终作用于线粒体，抑制再灌注时mPTP开放，抵御心肌IRI，体外实验SPostC能够减少近40%的梗死面积，然而糖尿病状态下其保护作用失活。本研究结果与前期研究相一致，低糖时，SPostC具有减轻再灌注后心肌损伤的保护作用，但对高糖浓度培养后心肌细胞IRI时，保护作用消失。考虑到CsA能够抑制mPTP开放，在高糖时联合应用CsA与SPostC有可能恢复SPostC的保护作用。然而结果表明，提前给予相同剂量的CsA后实施SPostC并未能恢复SPostC对高糖培养细胞的保护效应, 提示高糖浓度下单纯抑制mPTP开放并不能发挥保护作用, 其中还存在着更为复杂的调节机制。

心肌细胞线粒体形态与其功能状态紧密相关。SPostC与CsA发挥抗损伤保护作用的过程中, 均维持了心肌细胞线粒体的连接度及线粒体膜电位，高糖通过降低线粒体的连接度与线粒体膜电位加剧IRI, 并且SPostC与CsA在高糖条件下均失去对线粒体形态与膜电位的维持作用。高糖时二者合用也未能减轻IRI。另外，值得注意的是，本研究在CsA剂量选择与给药时机上参考了前期文献[25]，后期研究也可以尝试增大剂量或将给药时间延迟到再灌注开始前。此外，将高糖培养细胞再换回低糖后，是否会恢复保护作用尚不清楚，特别是不同高糖处理浓度与时间长短，是否存在不可逆性改变，还需要深入研究。

综上所述，本研究通过体外实验表明正常糖浓度时CsA同SPostC均能够通过调节心肌细胞线粒体形态抵抗缺氧/复氧损伤，但在高糖时该保护作用消失，并且联合CsA与SPostC无法恢复该保护效应。