不同电针对快速老龄化痴呆小鼠行为学和海马星形胶质细胞的影响＊

邵淑君，唐银杉，曹 瑾，许安萍，田朝阳，郭 郁，向杜炼，李志刚，邬继红＊＊

（1.北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029；2.浙江大学医学院附属第二医院中医康复科 杭州 310000）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）又称老年性痴呆，是一种起病隐匿的神经系统退行性疾病，是造成老年人痴呆的最常见原因，约占60%-80%。AD的主要临床表现为情景记忆障碍[1]、代谢失调[2]及晚期心理和身体活动的减少，给家庭和社会造成了极大的负担和压力。据统计，2010年全球痴呆患者约为3 560万，预计人数每20年翻一番，2030年为6 570万，2050年为11 540万[3]。目前，用于治疗AD的药物和方法十分有限且疗效欠佳，而针刺治疗具有整体调节、疗效好，起效快的特点，其疗效已被大量临床和动物实验证实[4-6]。

近年来研究发现，星形胶质细胞在AD等以认知功能障碍为主要表现的神经系统退行性疾病中发挥着重要的作用[7-8]。AD早期星形胶质细胞被广泛激活[9]，激活的星形胶质细胞可诱发多种炎症因子释放，加剧β淀粉样蛋白（beta amyloid protein,Aβ）沉积并诱导神经元功能障碍[10]，从而改善认知功能。因此星形胶质细胞是调节神经炎症的重要靶点。基于此，本实验拟从电针调节活化的星形胶质细胞的表达来探讨针刺干预治疗AD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康的清洁级快速老化小鼠亚系（Senescence accelerated mouse/prone8,SAMP8）小鼠，雄性，8月龄，体重30±2 g，共30只。采用随机数字表法将其分为模型组、音乐电针组和脉冲电针组，每组10只。同背景、同月龄正常老化小鼠亚系（Senescence accelerated mouse/resistance,SAMR1）小鼠10只作为空白组。以上实验动物均由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（津）2008-0001。于北京中医药大学动物中心屏障系统单笼饲养，实验前先适应性的喂养1周，自由进食进水。

1.2 主要试剂

免疫组化S-P超敏试剂盒（抗兔）、DAB显色试剂盒：福州迈新生物技术开发有限公司；兔抗单克隆GFAP抗体：美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG：北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 主要仪器

Morris水迷宫：上海移码数字有限公司；垂直电泳槽、转膜稳流电泳仪：美国Bio-Rad公司；4℃低温高速离心机：美国Thermo公司；LH-202型韩氏电针仪：南京济生医疗科技有限公司；ZJ-12H型音乐电针治疗仪：深圳市圣祥高科技有限公司；华佗牌无菌针灸针:0.25 mm*13 mm，苏州医疗用品公司厂。

1.4 干预措施

脉冲电针组：选取“百会”、“印堂”、“人中”（参照我国针灸研究会制定的“实验动物针灸穴位图谱”），用自制鼠套进行束缚，用华佗牌无菌针灸针（0.25 mm*13 mm）1寸毫针进行针刺，“人中”快速点刺后，“百会”、“印堂”皆向下平刺进针，进针深度为3-4 mm，针柄连接HANS-LH202型电针，电针输出频率为1 Hz，电压为2 V，电流强度为0.6 mA，针刺强度以针体微颤，小鼠头部微晃动为最佳，每次干预20 min，每天1次，共15天。

音乐电针组：针刺时用相同规格的鼠套进行束缚，选穴及针刺方法同脉冲电针组。“百会”、“印堂”连接音乐电针治疗仪，选取节奏明朗，速度与力度适中的的音乐处方《碧海杨帆》，强度以小鼠保持安静，不挣扎嘶叫为佳，20 min/天，每天1次，共15天。

正常对照组：在其他治疗组治疗的同时，抓取一次，并用相同规格的鼠套进行干预，20 min/天，每天1次，共15天。

模型组：同正常对照组。

1.5 Morris水迷宫

治疗结束后，采用Morris水迷宫测试小鼠定位航行及空间探索能力。Morris水迷宫系统由水迷宫装置（直径100 cm，高50 cm的圆形水池）、平台和图像自动采集、处理系统（包括摄像机，电脑显示器和分析软件）组成。随意将水池分为4个象限（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限），圆柱形平台直径5 cm，高28 cm，放置于第Ⅲ象限中央。实验开始之前，先在水池中注入温水（温度保持在21±2℃），水面高出平台表面1cm左右，再用墨汁将水水染成黑色，Morris水迷宫设置完成。①定位航行实验：测试时，先将动物置于平台上训练10 s，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限各选距离水池圆心相等的点作为入水点，然后将小鼠头朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水之后到上台的时间(即逃避潜伏期，escape latency)。小鼠登上平台5 s后终止记录，最长记录时间为60 s，若小鼠在60 s内仍不能登上平台，则引导其上台。各象限每天训练1次，共5天，做统计分析；②空间探索实验：将小鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限依次放入水中，每象限各训练一次，共5天，记录60 s内小鼠游泳总距离，做统计分析。

1.6 脑组织取材及相关指标检测

1.6.1 免疫组化方法

Morris水迷宫结束后第二天取材，每组小鼠随机选取5只，10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉（0.35 ml/100 g），3分钟后，打开胸腔，暴露小鼠心脏，将灌注针头经左心室插入升主动脉，同时剪开右心耳，快速滴注100毫升的生理盐水，至小鼠肝脏完全变白以及右心耳流出澄清的液体后，再快速灌注4%多聚甲醛，观察小鼠的肢体和尾巴僵硬后，立刻断头取出全脑，迅速将脑放入固定液（4%多聚甲醛）中。24 h后将固定后的脑组织进行酒精上行脱水、二甲苯透明后石蜡包埋，做连续冠状切片，片厚6 μm，选取海马结构完整且呈水平位的切片进行GFAP免疫组化ABC法检测。免疫组化染色的具体步骤：常规二甲苯脱蜡；下行梯度酒精水化；PBS洗3×3 min；0.01 mol·L-1的枸橼酸缓冲液热（温度90-95℃）修复抗原10 min；PBS洗3×3 min；滴加双氧水，10 min；PBS洗3×3 min；正常山羊血清室温下封闭10 min；滴加一抗GFAP抗体（均以1∶500稀释），4℃孵育过夜；PBS洗3×5 min；滴加生物素化二抗，10 min；PBS洗3×3 min；滴加生物素化三抗，10 min；PBS洗3×3 min；DAB显色液显色，自来水洗3×5 min；苏木素复染，自来水洗3×5 min；常规上行酒精脱水；二甲苯透明2×10 min；封片。以0.1 mol·L-1PBS代替一抗作为阴性对照组。采用Image-Pro Plus Analysis Software采集图像和分析。

表1 各组小鼠定位航行实验逃避潜伏期的比较(s，s)

表1 各组小鼠定位航行实验逃避潜伏期的比较(s，s)

注：与空白组比较，■P＜0.05，■■P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

n第4天44.99±7.25第5天39.16±5.92 53.46±7.67 40.19±6.39##43.03±6.73#组别空白组模型组音乐电针组脉冲电针组10 10 10 10第1天59.65±7.49 59.82±5.25 59.45±7.03 59.48±6.60第2天57.03±7.37 61.91±5.69 57.23±7.11 58.01±7.12第3天51.37±7.11 59.05±6.58 52.00±7.12 53.29±7.32 54.08±7.13 45.76±7.12#47.58±7.27#

表2 各组小鼠空间探索实验游泳距离的比较(s,m)

表2 各组小鼠空间探索实验游泳距离的比较(s,m)

注：与空白组比较，■■P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

1.6.2 蛋白免疫印迹法（western blot）

每组其余5只小鼠取新鲜海马组织，将海马组织迅速研磨，加入含100 μg·ml-1的蛋白裂解缓冲液50 μl，4℃裂解10 min，然后行4℃离心15 min，12000 rpm，吸取上清。Bradford法测定组织蛋白含量。采用5%的浓缩胶与10%的分离胶4℃过夜；行SDS-PAGE电泳；转移到PVDF膜；转膜后以5%PBS-T脱脂奶粉封闭，室温震荡60 min。封闭结束后，PBS洗膜2次。加入一抗GFAP抗体（以1∶1000稀释），室温孵育过夜。PBS洗膜，3×15 min。用辣根过氧化物标记的二抗孵育60 min，PBS洗膜，3×15 min。将PVDF浸入ECL（1∶1混）孵育，室温20℃，5 min。使用X光片曝光，常规方法显影定影，采用SPSS19.0软件分析扫描后胶片目的条带的灰度值。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 不同电针对SAMP8快速老龄化小鼠空间学习记忆能力的影响

2.1.1 定位航行实验

随着训练时间的延长，各组小鼠的逃避潜伏期都呈现下降的趋势。与空白组相比，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义（P＜0.01）。说明8月龄SAMP8快速老龄化小鼠模型成功，其具有明显的学习记忆障碍。与模型组相比，音乐电针组和脉冲电针组逃避潜伏期缩短，有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）（表1）。

2.1.2 空间探索实验

与空白组相比，模型组的游泳距离显著增长，差异有统计学意义（P＜0.01）。说明8月龄的SAMP8快速老龄化小鼠记忆保持力差。音乐电针组和脉冲电针组较模型组游泳距离缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.2 GFAP星形胶质细胞在小鼠海马CA1区免疫组化结果

海马CA1区GFAP免疫组织化学染色，其神经元阳性表达情况如图所示，阳性神经元以海马CA1区表达最为明显，阳性细胞胞质体积较大，多呈蜘蛛状，以胞浆表达为多见，偶可见胞核表达。空白组海马CA1区GFAP阳性细胞表达较少；模型组海马CA1区GFAP阳性细胞表达明显增过，且颜色深染，突起增长；音乐电针组和脉冲电针组GFAP阳性细胞表达较模型组减少（图1）。

图1 各组小鼠海马CA1区GFAP蛋白表达

图2 各组小鼠海马CA1区GFAP平均光密度比较（s，n=5）

图3 各组小鼠海马GFAP蛋白的表达情况

图4 各组小鼠海马GFAP相对表达量比较（s，n=5）

与空白组对比，模型组海马CA1区GFAP平均光密度明显增多，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组对比，音乐电针组和脉冲电针组小鼠海马CA1区GFAP平均光密度有明显下降趋势，有统计学差异（均P＜0.01），但与脉冲电针组对比，音乐电针组GFAP平均光密度减少，有统计学差异（P＜0.05）（图2）。

2.3 各组小鼠海马CA1区GFAP蛋白Western blot的表达结果

与空白组小鼠对比，模型组小鼠海马GFAP蛋白条带明显增粗，颜色加深，有统计学差异（P＜0.01）；与模型组对比，音乐电针组和脉冲电针组小鼠海马GFAP蛋白条带表达明显变浅，有统计学意义（均P＜0.05）；音乐电针组小鼠海马GFAP蛋白条带表达较脉冲电针组明显变浅，宽度变窄，有统计学差异（P＜0.05）（图3、图4）。

3 讨论

阿尔茨海默病属于中医的“痴呆”范畴，其病在脑。中医学认为“头为诸阳之会”，脑为“元神之府”，位贯脊中，充填于脑。《甲乙经·卷二》曰：“督脉者，起于下极之俞，并于脊里，上至风府，入属于脑，上巅循额至鼻柱，阳脉之海也”。因此督脉的主干与分支均与脑联系密切，故素有“病变在脑，首取督脉”之说。曹瑾[11]提出基于“督脉—脑—神”生理与病理上的密切关系，用“通督启神”法治疗“脑”相关的精神神志类疾病。“通督启神”法以“百会”、“印堂”、“人中”三穴为主要穴位。“百会”，位于巅顶，又名三阳五会，能通达阴阳脉络；“印堂”，位于两眉正中，功能镇惊醒神；“人中”，位于鼻柱下，醒神开窍，主治诸多精神疾患。三穴同用，共奏“通督启神”之效。

电针疗法是指针刺刺入人体穴位得气后，通过输入中低频脉冲电流，加强对穴位的刺激作用，但后期常因机体对其产生耐受性而疗效减退。音乐电针具有腧穴刺激和音乐治疗的双重作用。现代医学研究显示[12]，音乐本身可通过声波的传导，增加海马组织中单胺类神经递质多巴胺的含量，增加海马内兴奋性氨基酸转运体mRNA的表达，改善神经元形态和可塑性，起到镇静安神的作用，且音乐电针可将音乐节律转化为不同的频率和刺激强度，使其随音乐节律的变化而变化，克服了普通脉冲电针的耐受性缺点，在治疗老年性痴呆等神经精神疾病中取得了较好疗效[13-14]。

星形胶质细胞（Astrocytes，AS）广泛存在于中枢神经系统内，是中枢神经系统内所占比重最大的细胞群体，在应对损伤产生的刺激时，能合成和分泌多种细胞因子，如神经生长因子[15]，为神经元提供能量代谢底物，调节神经递质和免疫反应。在AD患者脑中，星形胶质细胞可能具有双向作用，一方面，AS可通过清除Aβ淀粉样沉积和限制炎症在大脑的传播起到保护神经元的作用[16]，同时，从活化的星形胶质细胞释放的炎性介质可诱导脑中的神经变性及退化，诱导炎症和神经毒性因子的额外释放，加速神经元的变性和死亡[17]，但是AS活化时对神经元的损害作用占明显优势[18]。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形胶质细胞特有的中间丝成分，对神经生理功能和各种病理过程具有重要作用，并被广泛作为星形胶质细胞的特异性标志物[19]。研究表明，神经元退化变性时海马区星形胶质细胞的炎症应答明显增加，炎性因子的活性增强[20]。最新研究表明，反应性星形胶质细胞为AD患者诊断的重要炎性病理标记物，例如Taipa R等在研究中通过检测星形胶质细胞的GFAP标记物，发现AD患者海马CA1区AS反应显著增高[21]。国内学者相关研究也表明，在AD模型小鼠中，海马区GFAP阳性细胞表达明显增多，面积增大，学习记忆能力明显降低[22-23]。

本实验结果显示，音乐电针和脉冲电针均可改善AD痴呆模型小鼠学习记忆障碍，但音乐电针对改善学习记忆获取能力有优于脉冲电针的趋势，而两者对空间位置探索记忆作用相当；在抑制GFAP蛋白表达方面，两种电针均可以明显减少海马CA1区GFAP表达，且与脉冲电针组对比，音乐电针组小鼠海马GFAP表达减少,表明电针治疗可以降低小鼠海马GFAP阳性细胞表达，抑制活化的星形胶质细胞，且音乐电针有明显优于脉冲电针的趋势。电针抗痴呆的作用机制复杂多样，通过减少星形胶质细胞的活化，抑制炎症因子对神经元的损害，以起到保护神经元作用可能是针刺抗痴呆的作用途径之一，这为今后的临床研究奠定了一定的实验基础。