甘草颜色与HPLC指纹图谱信息相关性研究＊

陈慧荣，林相龙，杨瑞琦，曹光昭，闫永红＊＊，邹慧琴＊＊

（1.北京中医药大学中药学院 北京 102488；2.北京宝德润生医药科技发展有限公司 北京 100088）

传统性状鉴别是中药饮片质量评价的有效方法，其中颜色是质量评价的重要指标之一，与其品质密切相关。如甘草自古以来以外皮红棕色、断面黄白色为佳，《本草经集注》称“赤皮断理，看之坚实者……最佳”[1]，《新编中药志》载“皮细紧、色红棕、断面黄白色、粉性足者为佳”[2]。颜色对甘草质量的鉴别至关重要。然而，传统性状鉴定法的感官颜色存在主观性强、描述模糊等局限性，缺乏客观标准。

色度学是研究人的颜色视觉规律、颜色测量的理论和技术的一门学科，在中药领域的运用能使中药颜色描述实现客观化、规范化。国际发光照明委员会（CIE）色度学系统以3色原理为基础，即任何一个颜色，都能用线性无关的3个原色适当的相加混合与之匹配。三原色可任意选定，但其中的任何一种原色均不可由其他两种原色相加混合得到。与待测颜色达到匹配时所需要的三原色的数量，称为三刺激值。本实验采用的是目前应用较为广泛的CIE1976L*a*b均色空间系统[3-5]，其中，明度L*、色度a*和b*三个坐标轴互相垂直。L*表示明度，明度越大，越偏白；明度越小，越偏黑；a*和b*表示不同的色调方向，+a*表示红方向，-a*表示绿方向；+b*表示黄方向，-b*表示蓝方向。

课题组前期研究，摸索并建立了甘草表面、断面颜色数字化的测量方法[6]，本研究在此基础上，采用色度学技术将甘草颜色客观化，并对其进行HPLC指纹图谱分析，探索整体化学成分质量与颜色的相关性。为将色度测定方法推广应用于其他药材的颜色测量提供理论依据，完善中药性状鉴别，推动传统学科发展创新。

1 实验材料

1.1 样品

收集来自甘肃西部地区、内蒙古杭锦旗、通辽、赤峰地区野生及栽培甘草样品共34份，所有样品经北京中医药大学中药资源与鉴定系闫永红教授鉴定，确定为甘草（乌拉尔甘草）Glycyrrhiza uralensis Fisch.，样品编号见表1。

1.2 仪器

ZN-02小型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；U-3010紫外可见分光光度计（日本日立公司）；Agilent 1100型高效液相色谱仪，四元泵，DAD检测器，自动进样器，柱温箱，Agilent 1100色谱工作站；DIKMA Platisil ODS色谱柱（5 μm，250×4.6 mm）；0.45 μm针筒式微孔滤膜过滤器；BP211D型1/100000电子分析天平（德国赛多利斯）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。

表1 收集的野生及栽培甘草样品基本信息

1.3 试剂

乙腈为色谱纯（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；甲醇、磷酸等为分析纯（北京化工厂）；水为屈臣氏纯净水；甘草酸铵标准品（供含量测定用，甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207，中国食品药品检定研究院，生产批号110731-200615）、甘草苷标准品（供含量测定用，中国食品药品检定研究院，生产批号111610-201005）。

2 实验方法

2.1 甘草断面颜色测量方法[7]

2.1.1 样品制备

将甘草切成长约2 cm的小段，对甘草段施以压力，令表皮脱落，将去皮的甘草段打粉，过3号筛，粉末置于自制玻璃测色皿中，盖上石英镜片，以测色皿中粉末不随意晃动为准。

2.1.2 颜色测定条件

采用日立3010紫外可见分光光度计进行测量，测量起止波长：380-780 nm；狭缝宽度：1 nm；照明光源：D65；视场选择：10度视角；扫描速度：600 nm·min-1。

2.1.3 精密度考察

取杭锦旗野生样品，按上述供试品制备方法制备供试品，连续测量5次。测量结果RSD均小于3%，结果间ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.09，色差低于人眼可变范围。表明结果稳定。

2.1.4 重复性考察

随机取杭锦旗野生样品5份，按上述供试品制备方法制备供试品，分别进行测量。测量结果显示RSD均小于3%，结果间ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.52，色差低于人眼可变辨范围。表明结果稳定。

2.2 HPLC指纹图谱方法的建立[8]

2.2.1 标准溶液的制备

精密称取甘草酸铵及甘草苷对照品，加入提取液（甲醇：5%氨水=80∶20），制成每1 mL含甘草酸0.2 mg、甘草苷0.2 mg的对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

将各甘草样品粉碎，过3号筛。精密称取0.1g于25 mL量瓶中，加入约25 mL提取液（甲醇：5%氨水＝80∶20），冷浸24 h。超声提取30 min（功率50 kw），放冷至室温，加提取液至刻度，摇匀后过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液，备用。

2.2.3 色谱条件

流动相A：0.1%磷酸水（每500 mL含7滴THF），流动相B：乙腈。梯度洗脱条件及检测波长见表2。流速为0.8 mL·min-1，进样量为15 μL，柱温24℃，检测时间为50 min。

按照按上述确定的供试品、对照品制备方法及测试条件进行样品分析（图1、2、3）。

2.2.4 精密度考察

取甘草酸含量相对较高的杭锦旗野生甘草样品为供试品。按供试品制备方法制备1份，以上述选定方法连续进样5次，考察方法精密度（图4）。

比较共有峰中，单峰面积大于5%总峰面积、分离效果较好的三个色谱峰的保留时间、峰面积，并计算相对标准偏差，色谱峰保留时间的RSD为0.05-0.08%，峰面积的RSD为0.14-0.51%。样品图谱经国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行自动匹配，不经多点校正，相似度在0.998-1.000之间（不包括自身比较），该方法精密度良好。

2.2.5 重现性考察

取杭锦旗野生甘草样品5份，按供试品制备方法提取，以上述选定方法依次进样各一次，扣除称样量差别（称样量尽量接近），考察方法重现性。比较共有峰中，单峰面积大于5%总峰面积、分离效果较好的三个色谱峰保留时间、峰面积，并计算相对标准偏差，色谱峰保留时间的RSD为0.19-0.2%，峰面积的RSD为1-2.25%，相似度在0.986-0.999之间（不包括自身比较），表明该方法重现性良好。

2.2.6 稳定性考察

用考察精密度的同一样品，分别在0，2，4，6，8，12，16，24，36，48 h进样，考察方法稳定性（样品于室温放置）。比较共有峰中，单峰面积大于5%总峰面积、分离效果较好的三个色谱峰的保留时间、峰面积，并计算相对标准偏差，相似度在0.997-1.000之间（不包括自身比较），表明供试液在24 h内稳定。

3 结果与分析

3.1 甘草断面颜色测量结果

对34批甘草样品分别进行断面颜色值的测量，每个样品重复测定三遍，记录颜色指标的平均值，结果见表3。实验选择L*a*b*色空间中L*、a*、b*的值作为颜色测量指标。

3.2 甘草样品HPLC指纹图谱测定结果

将所有栽培甘草样品指纹图谱进行叠加，用色谱指纹图谱相似度软件对其进行分析，得到了甘草栽培品HPLC对照指纹图谱，见图5，共计74个色谱峰，其中共有峰20个，占总面积的92%；通过对所有甘草野生指纹图谱进行分析，得到了野生甘草HPLC对照指纹图谱，见图6，经相似度软件分析匹配后，共给出79个色谱峰，其中共有峰17个，占总面积91%，见表4。

表2 甘草HPLC检测中流动相梯度条件及检测波长

图1 甘草对照品HPLC色谱图

图2 甘草栽培样品HPLC色谱图

图3 甘草野生品HPLC色谱图

图4 精密度考察

表3 甘草断面颜色测量指标值

表4 甘草HPLC指纹图谱共有峰保留时间

结合表4和图5及6可以看出，栽培甘草和野生甘草的HPLC指纹图谱中大多数指纹峰的峰形、保留时间基本一致，差异主要集中在40 min之后的18、19、20号峰。

结合文献[8]以及上述色谱图可知色谱图前段23 min以前以二氢黄酮苷、查尔酮苷和黄酮苷类成分为主，时间中段25 min到35 min以五环三萜类皂苷成分为主，40分钟之后以香豆素类和黄酮类为主。以此为据，初步将1-10号峰划为一组，其以黄酮苷类成分为主；将11-17号峰划为一组，其以三萜皂苷类成分为主；将18-20号峰划为一组，其以香豆素类成分为主。按照上述分类对34份甘草样品进行总结。

图5 栽培甘草HPLC对照指纹图谱

图6 野生甘草HPLC对照指纹图谱

以各指纹图谱中测得的甘草酸峰面积为1，计算各样品图谱中色谱峰的峰面积比值，求得三部分的相对峰面积和，结果见表5。

3.3 甘草断面颜色指标值与HPLC指纹图谱信息的典型相关分析

甘草样品颜色指标值L*、a*、b*与HPLC指纹图谱三组色谱峰相对峰面积和为两组连续变量，且经过主成分检验法均符合多元正态分布[9]，符合典型相关分析的条件。运用SAS9.4对34份甘草样品断面颜色指标值L*、a*、b*与HPLC指纹图谱三组色谱峰相对峰面积和做典型相关分析，得到3对典型变量（见表6）。典型相关系数用似然比法检验与0是否有显著差异，结果显示，第1、2典型相关系数具有统计学意义，第1、2典型相关系数分别为0.787035和0.603669，特征值的贡献率分别为73.67%，25.95%，前两对变量的累计贡献率高达99.62%。结果表明甘草断面颜色与HPLC指纹图谱有显著相关性。

4 讨论

在对中药材的质量控制上，多年来一直是通过对有效成分或指标性成分的含量测定来检测。目前有关甘草质量评价的报道很多，主要以用HPLC测定甘草酸、甘草苷等指标成分为主[10-14]。

表5 甘草三组色谱峰相对峰面积和

尽管以化学成分作为评价中药质量的标准更直观，但这种方法需要满足两个前提，一是中药材中所测得的的确是有效成分；二是所含的有效成分或指标成分的含量与所有有效成分的含量比是固定的。但是每一味中药材中都含有多种成分，是一个复杂的系统，不同的有效成分以及有效成分不同的含量比例使每一味中药材看起来更像一个中医复方。因此，经过几千年临床验证而总结的传统药材性状仍具有很高的价值。

中药色泽是中药质量标准的重要指标之一，越来越多的学者关注了中药及中药饮片的颜色测量。邹慧琴等[7]基于色度学理论建立了甘草断面及表皮颜色指标数字化的方法；熊吟等[15]使用色度计对金银花粉末进行测量，并结合药材内部物质含量测定结果进行相关性分析，结果金银花颜色值与所含总黄酮含量相关；谢晋等[16]发现丹皮饮片断面的颜色b*值与饮片中所含丹皮酚的含量存在稳定的相关性。

表6 甘草断面颜色与HPLC指纹图谱的典型相关分析

通过中药外观色泽的客观量化，有望建立一套具有中医药特色的中药质量评价方法，为中药现代化提供新思路。然而中药饮片大多形态体积不一、表面粗糙不平，需要对测量面进行预处理，使色度测量具有一定困难。另外，对中药的人为染色也是中药“辩色论质”的新挑战[5]。