参芪益智颗粒对APP/PS1转基因小鼠血清MMP2和VEGF含量的影响＊

秦莉霞，魏江平，文 雯，潘 婷，徐世军＊＊

（1.成都中医药大学药学院 成都 611137；2.成都中医药大学中医脑病药物整合转化研究所 成都 611137）

阿尔茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一种临床上以学习记忆障碍，认知功能障碍，人格和行为改变为特征的中枢神经系统退行性疾病[1]，是老年痴呆的主要病症[2]。血脑屏障（blood brain barrier，BBB）是维持中枢神经系统稳态核心屏障[3]。今年的权威评论文章指出BBB破坏在AD及其他退行性疾病形成过程中扮演重要角色并是今后研究神经相关疾病的重要方向[4]。神经影像学研究指出MCI和早期AD患者海马、部分白质和灰质部位均可见BBB损伤[5-7]。高级动态增强磁共振成像（MRI）检测也发现中枢神经系统脑微出血增加可以反映脑微血管完整性的破坏[7-10]。然而BBB破坏与外周相关损伤因子密切相关，因此调节外周损伤因子对AD干预有一定的治疗作用。

血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是一种神经细胞衍生的生长因子。它在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中分布广泛[11]，不仅能够维持血管生成和血管渗透作用，还具有一定的神经元保护作用[12]。MMP2属于基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）家族。MMPs是细胞外基质金属蛋白酶体的重要组成部分，它们既可以影响CNS细胞外基质的重塑和降解，又可以参与调节BBB的通透性[13]。参芪益智颗粒是根据王永炎教授长期临床经验提炼的经验方，具有益气健脾、活血化瘀、安神益智、解毒通络之效。课题组前期研究发现参芪益智颗粒对5XFAD小鼠脑内老年斑的数量、胶质细胞过度激活和脑内Aβ1-42的含量均有一定的调节作用[14]，但对于外周血中相关影响因子尚未进行研究。故本研究以APP/PS1双转基因小鼠为研究载体，考察参芪益智颗粒对该模型小鼠学习记忆能力、病理形态学和血清内VEGF和MMP2含量变化，为参芪益智颗粒治疗AD提供依据。

表1 参芪益智颗粒对APP/PS1痴呆小鼠避暗实验的影响

1 材料

1.1 药物与试剂

参芪益智颗粒（SYG）由北京师范大学提供，批号：20151215；盐酸多萘哌齐片，卫材中国药业有限公司制造，批号：1607020；苏木精，美国Thermo Fisher，批号：20170308；伊红，美国Thermo Fisher，批号：20170308；小鼠VEGF和MMP2 ELISA试剂盒均为依科赛生物科技（太仓）有限公司产品，批号分别为：EM009-96、21G359。

1.2 动物

45只SPF级APP/PS1双转基因小鼠，3月龄，雌性，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2014-0004。

1.3 仪器

Morris水迷宫分析系统（荷兰，Noldus）；PAT-8避暗实验视频分析系统（成都泰盟）；OFT-100大小鼠开场活动实验系统（成都泰盟）；TDZ5-WS离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；KD-98-IIA恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；3001酶标仪（Thermo electron corporation）；DM1000徕卡显微成像系统（德国，Leica）；UC7超薄切片机（德国，Leica）。

2 方法

2.1 分组及给药

将45只APP/PS1小鼠按体重随机分为5组，即模型组，安理申组（1.5 mg/kg），参芪益智颗粒高（12.6 g/kg），中（6.3 g/kg），低（3.15 g/kg）3个剂量组，另取10只同月龄C57BL/6小鼠作为对照，给药体积10 ml/kg，1次/d，连续灌胃给药180d，模型组和对照组给予等体积蒸馏水。

2.2 行为学评价

避暗实验记录各小鼠第二天检测的逃避潜伏期和错误次数为评价指。Morris水迷宫中记录隐藏平台实验连续训练5天的逃避潜伏期为评价指标；记录空间探索实验小鼠穿越平台次数和平台象限所占时间百分比为评价指标。开场试验记录各小鼠站立次数，运动时间及静止时间为评价指标。

2.3 HE染色

行为学试验结束24 h后，眼球取血，3500 r/min离心10 min分离血清，-20℃保存备用；脱颈椎处死小鼠，冰浴取脑，分离左侧海马，用4%多聚甲醛固定，常规HE染色法操作，观察海马CAI区组织病理学变化。

2.4 MMP2和VEGF含量检测

取冻存血清及试剂盒相关试剂恢复至室温，严格根据对应试剂盒说明书操作，分别测定血清MMP2和VEGF含量。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 SYG对APP/PS1双转基因小鼠避暗实验的影响

由表1可知，与空白组比较，模型组逃避潜伏期缩短，错误次数增多（P＜0.05），与模型组比较，SYG组的逃避潜伏期延长，错误次数降低。

3.2 SYG对APP/PS1双转基因小鼠Morris水迷宫学习记忆能力的影响

由图1可知，与空白对照组比较，模型组逃避潜伏期明显延长（P＜0.05）；进入平台象限次数和进入平台象限百分比显著减少（P＜0.05）；与模型组比较，SYG给药组逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05）；进入平台象限次数和进入平台象限百分比显著增多（P＜0.05）。

3.3 SYG对APP/PS1双转基因小鼠开场运动能力的影响

由表2可知，与空白对照组比较，模型组小鼠运动时间，运动总路程，站立次数均显著减少（P＜0.05）；与模型组比较，SYG中、低剂量组给药组静止时间，运动时间，运动总路程均显著增加（P＜0.05），SYG高剂量组站立次数显著增多（P＜0.05）。

图1 SYG对APP/PS1小鼠Morris水迷宫的影响

表2 SYG对APP/PS1小鼠开场实验的影响（s）

表2 SYG对APP/PS1小鼠开场实验的影响（s）

注：与空白组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

站立次数/次20.83±2.32*9.50±6.44#11.83±4.07 21.00±2.67*8.83±4.22 11.83±7.08组别空白组模型组安理申组SYG高剂量组SYG中剂量组SYG低剂量组给药剂量/（g·kg-1）— —1.5 12.6 6.3 3.15静止时间/s 110.44±3.58 119.70±18.71 128.23±14.75 125.62±9.58 151.21±8.53*149.29±15.14*运动时间/s 197.41±7.22*180.37±18.71#171.84±14.75 174.45±9.58 145.22±9.27*150.78±15.14*总路程/cm 2070.73±188.45*1762.65±259.51#1675.78±334.09 1769.78±232.86 1395.61±224.59*1233.54±253.69*

3.4 SYG对APP/PS1双转基因小鼠海马组织病理学的影响

由图2可知，与空白对照组比较，模型组海马神经细胞数量明显减少，排列稀疏，可见细胞固缩及空泡化；与模型组比较，SYG各给药组神经细胞数量减少，排列稀疏，细胞固缩及空泡化现象明显缓解。

3.5 SYG对APP/PS1双转基因小鼠血清MMP2和VEGF含量的影响

由图3可知，与空白对照组比较，模型组血清MMP2和VEGF含量均显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，SYG各给药组血清MMP2和VEGF含量均显著降低（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01，P ＜ 0.001）。

4 讨论

距1906年德国医生阿洛伊斯·阿尔茨海默（Alois Alzheimer）公布AD以来已有100多年历史，然而对其产生机制仍不清楚。值得注意的是AD并非现代人专利，2000多年前我国已经有类似的记载，历代累积了大量文献资料及应对方药。AD属于中医“喜误”、“喜忘”、“呆病”、“恍惚”、“失志”等范畴，其本质是本虚标实证，由外部环境（如风、寒、湿、疫等）和和内部因素（痰、瘀）共同作用致病。“毒损脑络”是王永炎院士提出的痴呆病变机制，而解毒通络则是治疗痴呆的关键手法。参芪益智颗粒是基于此理论上的经验方，方中黄芪、黄芩、人参有效活性成分黄芪皂苷[15]、黄芪多糖[16]、人参多糖[17-18]、黄芩苷[19]等可通过多种机制改善AD动物模型病理进程。前期实验也证实参芪益智颗粒可改善AD动物模型学习记忆能力，本次研究也观察到相同的实验结论。参芪益智颗粒不仅能够改善APP/PS1小鼠学习记忆障碍，还可以调节其精神行为异常。

BBB是控制中枢神经系统稳态的唯一屏障，而包括AD在内的多种神经系统疾病的研究中显示BBB功能出现障碍[20-23]。AD患者影像学研究和尸检报告均显示存在BBB损伤[5-10,24]，同时一些动物模型如APP/PS1小鼠[25]和5xFAD小鼠[26]均存在BBB破坏。BBB破坏与心血管性疾病如动脉粥样硬化和高血压等密切相关，并与一些血管因子和酶异常有关。VEGF与血管生成、神经元活性、轴突可塑性、血管通透性密切相关[27]，且参与调节中枢系统疾病BBB的渗透和病理进程[28-29]，MMPs参与神经血管生成的同时，在如中风等神经系统疾病中表达增加[30-31]，其家族成员MMP2和MMP9参与调节BBB相关蛋白降解的同时参与调节BBB通透性[32-34]。因此改善外周VEGF和MMP2含量对BBB有保护作用。本研究结果显示参芪益智颗粒可降低AD模型动物血清中MMP2和VEGF的含量。综上可知参芪益智颗粒改善APP/PS1小鼠学习记忆功能可能与以下两方面有关：直接改善脑内AD病理变化；调节外周BBB破坏的潜在影响因子，阻止AD病变。

图2 SYG对APP/PS1小鼠海马CA1区病理状况的影响

图3 SYG对APP/PS1小鼠血清MMP2和VEGF含量的影响