新疆维吾尔族及哈萨克族慢性阻塞性肺疾病易感性与肿瘤坏死因子-α-308基因多态性的相关性研究

高 云 谢小兵

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，是一种严重危害人类健康的常见的以持续性气流受限为特征的呼吸系统疾病之一，具有较高的致残率和致死率。随着环境污染日益加重，人口老龄化的加速和吸烟人数的增多，COPD的发病率和病死率正逐年增高。目前认为COPD的发生发展可能与环境因素、遗传因素和个体易感因素相关，且发病机制在不同的基因和不同的环境因素及不同种族人群的COPD患者中不同[1-2]，流行病学调查发现COPD具有家族聚集倾向和种族地域差异性[3]。有关其发病的确切机制目前尚未完全明了，公认的机制包括炎症反应机制、氧化/抗氧化失衡，蛋白酶/抗蛋白酶失衡机制等，其中炎症过程是目前公认的主要致病机制[4]。

近年来有研究发现肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)在COPD患者的痰液及血液中均能检测出其水平增高[5]，是导致COPD、肺实质受损及慢性炎症损伤的细胞因子在COPD的发病过程中起着重要作用[6]。TNF-α的基因序列分析显示，在启动子-308位点存在多态性，该位点多态性对TNF基因的转录和表达有一定的影响[7]。目前对COPD与TNF-α-308基因多态性的相关性研究结论不一，有研究发现[8-9],TNF-α-308与亚洲患COPD的人群存在相关性，但与高加索地区患COPD的人群无相关性。这些研究提示COPD的易感性与TNF-α-308基因的多态性在不同人群中的作用机制可能不同。因此，本研究通过分析新疆维吾尔族、哈萨克族COPD组与对照组TNF-α-308位点基因型的分布特点，来探讨该基因的多态性与新疆维吾尔族、哈萨克族人群COPD易感性的关系。

资料与方法

1.研究对象 选择2014年1月至2016年1月,在我院老年医学中心一病区住院治疗的维吾尔族及哈萨克族COPD患者各80例为病例组，诊断均符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013年修订版)》的标准[10]，同时选择于我院体检的维吾尔族及哈萨克族健康体检者各80例为对照组,其中维吾尔族健康对照组中男性48例；女性32例，哈萨克族男性51例，女性29例；平均年龄分别为(55.2±6.7)岁、(54.3±8.1)岁。病例组：维吾尔族COPD患者平均年龄(52.3±6.4)岁；男性43例，女性37例；哈萨克族COPD患者平均年龄(53.7±5.8)岁；男性39例，女性41例。以上四组在年龄、性别，BMI及吸烟指数等一般资料的比较,均差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，且入选对象均为无血缘关系的人群。所有入选患者及健康志愿者均知情同意，并签署知情同意书。

(1)纳入标准 病例组：诊断均符合中华医学会呼吸病学会2013年制定的《慢性阻塞性肺病诊治指南》修订版[10]中COPD的诊断标准：即规定吸入支气管扩张剂后第一秒用力呼气容积(FEV1)/用力肺活量(FVC)<70%，且FEV1小于预计值的80%，FEV1预计值增加≤12%，同时伴有COPD的临床症状如气促、气喘、慢性气道阻塞。对照组：均符合以下条件：胸X线片或胸部CT正常；且肺功能符合以下指标：FEV1/FVC>70%，且FEV1大于预计值的80%。病例组及对照组各研究对象均为长期居住在新疆地区且无血缘关系及无无异族通婚史的人群。

(2)排除标准 ①合并有严重支气管哮喘、支气管扩张疾病及其他部位感染等全身炎症反应性疾病；②合并有严重的糖尿病、心、肝、肾、血管疾病；③合并有肺间质纤维化、肺结核、肺癌等其他影响肺功能的疾病；④肿瘤、神经系统疾病以及自身免疫性疾病；⑤精神病患者；⑥近期使用免疫抑制剂、糖皮质激素、非甾体类抗炎药物者；⑦近期外科手术史。

2.标本的采集与保存 对所有参与此次研究的病例组及健康对照组成员在清晨空腹使用真空负压EDTA-K2抗凝管采集肘静脉血标本5mL，将抗凝管上下轻轻颠倒使血液与抗凝剂充分混匀，标写编号，-20℃低温冰箱保存备用，待取DNA。

3.主要试剂 人外周血基因组DNA提取试剂盒(大连宝生物有限公司)；DNA Marker(北京百泰克生物技术有限公司)；琼脂糖(西班牙Sigma公司)；5×TBE电泳缓冲液(上海生工生物工程有限公司)；2×TapPCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)；DNA快速纯化/回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；限制性内切酶Ear1(北京天根生化科技有限公司)；无水乙醇(西安浦化学试剂有限公司)，6×Loading Buffer缓冲液(北京百泰克生物技术有限公司)。

图1 TNF-α-308位点酶切结果 A：AA 基因型：134bp；B：GA基因型：134bp、87bp、 20bp；C：GG 基因型：87bp和20bp,注：M：Marker带

图2 TNF-α-308位点测序结果 A：野生型纯合子GG型；B：突变 型杂合子GA型；C：突变型纯合子AA型

4.主要仪器 低温高速离心机(Heraeus公司，德国)，1000型PCR扩增仪和GelDoc2000凝胶成像仪(Bio-Rad公司，美国)，FR-250型电泳仪(上海复日科技有限公司)，KDB-80型水浴箱(重庆实验设备有限公司)，Eppendorf移液器(德国)。

5. 引物的设计与合成 参照Sakao S[11]等设计的TNF-α-308位点的引物，引物由大连宝生物工程有限公司合成。上游引物序列为5′-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3′，下游引物序列为5′-GAGCGT CTGCTGGCTGGGTG -3′。

6.基因组DNA提取 按照说明书应用血液基因组DNA提取试剂盒提取，将血液样本取出，室温下解冻，然后将全血颠倒混匀后，用移液器吸取3mL全血至无菌离心管内加入细胞裂解液，使其充分与血液混匀后10 000r/min离心5min，弃上清液重复上述步骤1～2次后向每个离心管内加入异丙醇进行充分颠倒混匀直至出现白色絮状物(即DNA)。

7.采用PCR法检测样本DNA PCR总反应体系30μL，DNA模板3μL，10×Buffer 5μL，上游下游引物各3μL， Taq DNA聚合酶10μL，无菌去离子水补足至总反应体系30μL。PCR反应的扩增条件为：95℃,5min,预变性5min，共35个循环，其中95℃,变性30s，63℃,退火40s，72℃,延伸60s，末次延伸72℃,10min终止反应，4℃保存。用2%的琼脂糖凝胶对PCR产物扩增片段进行电泳检测，在凝胶电泳成像仪下观察样品扩增的情况。

为进一步验证PCR扩增产物的基因型，随机选取纯化后的三种基因型PCR扩增产物送往北京六合华大基因科技股份有限公司进行基因序列分析，。

8.统计学方法 采用SPASS17.0统计软件进行分析。对各组间基因型和基因频率数进行采用χ2检验； Hardy- Weinberg遗传平衡定律的吻合度检验采用χ2检验；计量资料采用均数±标准差表示，各组间数据的比较采用t检验；采用多因素Logistic回归分析，计算OR和95%可信区间用来检测TNF-α-308位点基因多态性和COPD的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.TNF-α-308位点限制性片段长度多态性聚合酶链反应基因分型 基因的PCR扩增产物被限制性内切酶处理后，经检验扩增良好，无非特异性扩增，扩增片段大小与实际相符，经琼脂糖凝胶电泳检测发现TNF-α-308存在以下3种基因型：GG、GA、AA，其中GG为野生型纯合子，片段长度为87bp和20bp，GA为突变型杂合子，片段长度为134bp、87bp和20bp，AA为突变型纯合子，片段长度为134bp。见图1。

2.TNF-α-308测序结果及基因型的判定 采用反向测序法进行检测，通过对测序图进行分析，测序结果显示，TNF-α-308位点存在3种基因型：GG、GA和AA，测序结果见图2。

3.哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡吻合度检验 根据基因测序结果，通过卡方检验分别统计实验个体中TNF-α-308位点的3种基因型：GG、GA和AA，结果显示各组TNF-α -308位点的基因型符合Hardy- Weinberg基因型遗传平衡定律(P>0.05)，说明样本具有群体代表性，可以反映两民族人群基因的整体分布情况。

表1 两民族间TNF-α-308位点基因型和等位基因频率分布的比较[n(%)]

表2 两民族间TNF-α-308位点的基因型及等位基因与COPD易感性的关系[n(%)]

4.两个民族TNF-α-308位点的基因型和等位基因频率分布的比较 新疆维吾尔族和哈萨克族的COPD组和对照组中，TNF-α-308位点均以GG基因型及G等位基因多见，两组比较COPD组的AG基因型、AA基因型和A等位基因均高于对照组，且两组间的基因型及等位基因频率的分布，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

5.TNF-α-308位点的基因型及等位基因与COPD易感性的关系 通过Logistic 回归分析，以研究对象是否患COPD为因变量，以年龄、性别、三种基因型为协变量，调整年龄、性别后进一步分析结果显示：维吾尔族和哈萨克族COPD组AG基因型(46.3%，35%)、AA基因型(10%，6.3%)及A等位基因频率(30%，25.6%)均高于对照组，差异有统计学意义(P=0.001，OR=0.149，95%CI=0.041～0.375；P=0.001，OR=0.158，95%CI=0.079～0.389；P=0.001，OR=0.107，95%CI=0.012～0.821；P=0.013，OR=0.357，95%CI=0.054～2.121；P=0.015，OR=0.323，95%CI=0.132～0.807；P=0.015，OR=0.343，95%CI=0.189～0.821)，提示携带AG和AA基因型的患者COPD发病风险增加，A等位基因可能是COPD发病的危险因素，见表2。

讨 论

COPD 是一种由多个易感基因参与的复杂疾病，气流受限不完全可逆且呈进行性的发展，受外部环境、宿主自身等因素的联合作用在肺的不同部位，激活中性粒细胞、肺泡巨噬细胞和T 细胞等产生炎症反应，从而加重COPD 的发生[10]，且不同的基因以及不同的环境因素，在不同COPD 患者人群中的发病机制不同[12]。研究发现其遗传方式是每个基因只发挥一部分作用，并不是单个主基因发挥作用这不符合单基因遗传方式，这提示COPD 的发病具有一定的遗传性，目前已发现有多种基因与COPD 的易感性有关，并且在地域及种族方面存在着差异，因此有必要进一步了解多种遗传因素的作用机制及其在COPD发展中的作用，为COPD的预防和诊疗工作提供理论依据。

COPD 是以气道、肺血管和肺实质的慢性炎症为其主要的病理特点，炎症反应导致小气道、肺泡壁及肺结缔组织损伤，最终导致COPD 的发生。COPD 患者肺内被激活的炎症细胞可释放多种炎症因子，包括TNF-α、白三烯、白介素等，这些炎症因子可增强炎症细胞的炎症反应，从而使肺组织结构进一步破坏，因此COPD 发病中的关键环节是气道炎症[3]。TNF-α 是一个多功能的细胞因子，具有多种功能和广泛的生物学特性，由巨噬细胞和单核细胞产生，它能够改变平滑肌细胞的功能，从而促进气道重构，参与调节肺部炎症，因此被认为在慢性肺疾病发病过程中起重要作用。TNF-α影响肺功能的可能机制如下：①TNF-α可增强炎症细胞的黏着、趋化及侵润过程，使脂类介质、活性氧自由基及细胞因子等释放增多，是重要的炎症反应介质；②可能使血管内皮细胞的通透性增加，使毛细血管渗漏，使肺严重损伤，从而使肺功能下降；③TNF-α还能诱导黏附因子的合成与释放，造成组织纤维增生，进而使气道重塑肺功能受损加重。TNF-α的基因多态性与它的功能相关，基因启动子区的多态性可能会影响其转录水平[13]。由于TNF-α基因启动子区-308 位点G/A 突变能显著影响TNF-α基因的表达水平，提示TNF -α基因-308多态性在COPD 的发病过程中起重要作用。

相关研究发现[14]，TNF-α基因的腺嘌呤(A)/鸟嘌呤(G)在-308 位点上有转换，当脂多糖刺激时A 等位基因的杂合子个体，产生的TNF-α较GG 基因型多。Sakao等[11]用PCR 技术检测日本群体中对照组和COPD 组的血淋巴细胞基因DNA，发现TNF-α基因型在两者间有明显不同，且-308位点AA 纯合子和GA 杂合子基因型都使COPD 的发病风险增加。而在白种人群中的研究没有发现两组之间的基因型有差异[15]。国内对TNF-α-308与COPD的相关性研究发现[16-17]，TNF-α-308位点的多态性与亚洲人群COPD的发病相关，汉族人群在排除了年龄、性别、吸烟等因素对实验的影响外，TNF-α-308等位基因与COPD患者的易感性存在相关性。而龚燕等[18]在汉族人中的研究结果显示，该基因位点的多态性与COPD的易感性无关。王妨娥、吴水淼等[19-20]，在对新疆维吾尔族和哈萨克族TNF-α-308位点基因多态性与COPD易感性的研究中发现，TNF-α-308位点的基因型和等位基因的频率在COPD组和对照组之间差异有统计学意义，TNF-α-A等位基因可能是COPD的危险因素。目前有关COPD 与TNF-α基因-308 多态性的相关性研究中，其分析结果在不同的种族并不一致，因此有必要继续对其他种族 TNF-α-308位点的基因多态性与COPD的相关性做进一步的研究，以确定该位点的基因多态性在COPD 发生发展中的作用。

本研究中各组基因型的分布，根据基因测序的结果分别统计TNF-α-308位点的3种基因型：GG、GA和AA结果显示，各组TNF-α -308位点的基因型符合Hardy- Weinberg基因型遗传平衡定律(P>0.05)，说明样本具有群体代表性，可以反映维、哈两民族人群基因的整体分布情况。我们通过对新疆维、哈两民族TNF-α-308位点基因型和等位基因频率的分布进行比较发现，两组均以G等位基因及野生纯合GG基因型多见，研究结果显示COPD组的AG基因型、AA基因型和A等位基因均高于对照组，且两组间的基因型及等位基因频率的分布差异有统计学意义(P<0.05)，TNF-α -308位点的A等位基因可能是新疆维吾尔族和哈萨克族COPD发病的高危因素，而携带A等位基因及AG和AA基因型的患者发病风险相应增加，提示TNF-α-308位点基因的多态性与新疆维、哈两民族COPD的易感性相关。本研究结果与文献[21-22]相似，进一步说明TNF-α- 308位点基因多态性与COPD发病存在明显的相关性。

综上所述，TNF-α-308位点相关的基因型及等位基因频率可以作为遗传性标记在临床上进行检测，用于早期发现维吾尔族及哈萨克族COPD易感的高危人群，对于预防COPD的发展有着重要的意义，由于COPD在不同的种族及人群中的易感性，可能存在一定的差异，而且COPD是一种比较复杂的多基因遗传性疾病，因此我们需要进一步扩大样本量在后续的研究中，为最终揭示遗传因素如何影响COPD 发生、发展的具体作用机制的进一步深入研究提供理论依据。