双歧杆菌对高糖高脂饮食与STZ诱导小鼠肠道菌群及肾功能影响的研究

高雁鸿, 王 耀,张年萍

（1.大同市第五人民医院内分泌科，山西大同037009;2.山西大同大学第一临床医院，山西大同037009；3.大同市第五人民医院输血科山西大同037009；4.山西大同大学医学院，山西大同037009）

随着生活水平的提高，饮食种类和方式变得越加丰富，但也随之而来产生诸多健康问题，比如慢性疾病的发生率逐年增高。全世界不少人正饱受慢性疾病的困扰，糖尿病是仅次于继癌症和心血管疾病的高发病率疾病[1]，是全球关注的公共健康问题。肠道菌群是人体肠道微生物种类总称，具有调节机体免疫、吸收和代谢等生理作用。研究发现[2]，糖尿病的发病和发展与肠道菌群存在很大联系，调节2型糖尿病患者肠道菌群结构可改善胰岛素抵抗、糖代谢紊乱和氧化应激等病理性改变。双歧杆菌(bifidobacterium)是一类肠道主要有益菌群[3]。研究发现2型糖尿病患者肠道双歧杆菌属总量显著减少[4]，但其中机制尚不清楚。本研究采用2型糖尿病小鼠造模与双歧杆菌干预同时进行的实验方法，检测双歧杆菌干预2型糖尿病小鼠后对肠道菌群及对肾功能的影响，为治疗糖尿病的辅助疗法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

体质量15～20 g的3～4周龄C57BL/6J健康雌性小鼠，数量为30只，购自上海实验动物中心。将小鼠分为正常对照组、模型组和双歧杆菌干预组，每组10只。正常组给予标准饲料；模型组给予高脂高糖饲料，6周后腹腔注射链脲佐菌素（STZ）1%(20 mg/kg)腹腔注射；双歧杆菌干预组给予高脂高糖饲料+双歧杆菌，6周后STZ腹腔注射，剂量和浓度与模型组一致，同时给予双歧杆菌灌胃，连续喂养8周。

1.2 仪器试剂

厌氧液体培养基（北京陆桥技术公司）培养双歧杆菌，培养至对数生长期后菌落计数，以2×109CFU的菌液进行灌胃。DNA Marker、5×Loading buffer来源于北京擎科生物生物技术公司，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、2×PCR MASTER MIX来源于赛默飞生物科技公司，链脲佐菌素(STZ)来源于Sigma公司，粪便DNA提取试剂盒来源于Sigma公司，DNA纯化试剂来源于QIAGEN生物工程有限公司。全自动生化分析仪，迈瑞BS-220，三诺血糖仪、代谢笼等。肌酐、尿素氮检测剂盒，均来源于宁波美康生物科技有限公司。

1.3 标本采集及处理

最后一次灌胃后禁食14 h，血糖仪检测空腹血糖，收集24 h尿液并记录尿量，无菌收集各组小鼠粪便，-80℃保存，股动脉取血，收集3 mL血液，3000 r/min离心10 min，获得血清，-20℃保存。

1.4 小鼠肾功能测定

全自动生化分析仪检测尿微量白蛋白(Alb)、尿肌酐(Cr)、计算尿Alb/尿Cr(ACR)、24 h尿蛋白定量，试剂盒检测血清肌酐（SCr）、血清尿素氮(BUN)。

1.5 T-RFLP技术分析肠道菌群

1.5.1 粪便DNA的提取

根据粪便DNA提取试剂盒说明书提取DNA。

1.5.2 PCR扩增

16S rRNA基因通用引物:F:5'TGCCAGCAGCCGCGGTA-3'(5'-FAM标记);R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，50 μl体系:0.5μl EXTaq酶，25μl 2×PCR MASTER MIX，F,R（10μlmol/L）各0.5μl，0.5μl 8-Methoxypsoralen（8-MOP）（2.5mg/mL），2 μL模板，加去离子水至50 μL，PCR反应条件为:95℃预变性10 min,95℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸1 min，40个cycle，72℃终延伸10 min。

1.5.3 限制性内切酶酶切

37℃水浴4 h，70℃水浴30 min，酶切反应体系见表1，酶切产物用普通DNA产物纯化试剂盒纯化回收。

表1 酶切反应体系

1.6 统计分析

计量数据均以均数±标准差表示。用SPSS19.0软件对数据进行方差分析，组间比较采用LSD检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双歧杆菌干预对 2型糖尿病小鼠血糖的影响

模型组小鼠空腹血糖为20.2 mmol/L，明显高于正常对照组(P＜0.01)，提示造模成功。与模型组相比，双歧杆菌干预组空腹血糖为8.2 mmol/L，明显降低(P＜0.01)，但仍高于正常对照组，提示双歧杆菌干预改善糖代谢，但不可完全恢复至正常水平。

2.2 双歧杆菌干预对 2型糖尿病小鼠肾功能的影响

与正常对照组比较，模型组Scr、BUN、24 h尿蛋白水平、ACR升高(P＜0.05)。与模型组比较，双歧杆菌干预组小鼠Scr、BUN、24 h尿蛋白水平、ACR均明显降低(P＜0.05)，结果见表2。

表2 各组小鼠Scr、BUN、24 h尿蛋白、ACR水平

2.3 双歧杆菌干预对2型糖尿病小鼠肠道菌群的影响

与正常对照组相比，模型组、双歧杆菌干预组肠道微生物丰度显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，但双歧杆菌干预组与模型组无显著差异（P＞0.05）。提示2型糖尿病小鼠肠道菌种数量显著下降，但即使双歧杆菌干预这种情况仍不能改善。在肠道菌群多样性指数上，模型组和对照组无显著差异，但双歧杆菌干预组其多样性指数均显著低于模型组和空白组(P＜0.05)，提示双歧杆菌干预后，影响了小鼠肠道其它菌群的数量或活性，降低生物多样性。但各组小鼠之间的物种均度没有明显差异，表明各组小鼠肠道菌群主要菌种含量并无显著差异，结果见表3。

表3 各组小鼠肠道菌群多样性分析

与正常对照组相比，模型组双歧杆菌明显下降，差异具有显著性(P＜0.05)，双歧杆菌干预组含量显著高于模型组(P＜0.05)，但与正常对照组无明显差异(P＞0.05)。肠道3种主要菌含量均无显著差异(P＞0.05)。

表4 各组小鼠4种主要肠道细菌相对含量

3 讨论

2型糖尿病是全球关注的人类内分泌代谢性疾病，诱导因素包括基因调控及环境变化。研究发现，肠道菌群具有调节机体营养吸收及代谢、免疫作用及内分泌等生理功能，与2型糖尿病等代谢性疾病关系密切[5]。双歧杆菌是人体肠道内的主要益生菌，其活性和数量变化与机体生理病理密切相关[6-7]。双歧杆菌可调节平衡肠道正常菌群，抑制病原微生物的生长，临床上常用于治疗便秘和胃肠疾病等。研究显示，2型糖尿病患者肠道双歧杆菌属显著减少[8]，但其机制尚未研究清楚。

本研究采用双歧杆菌干预2型糖尿病小鼠模型，按照小鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L的诊断标准，提示模型组和双歧杆菌干预组造模成功。双歧杆菌干预组其空腹血糖明显下降(P＜0.05)，提示双歧杆菌具有明显降低血糖的疗效。以往研究显示，双歧杆菌具有降低血糖，改善糖代谢的调节作用，本研究结果与之前文献报道一致[9-10]。其机制可能是糖尿病小鼠肠腔黏附的革兰阴性杆菌显著增加，并被肠腔黏膜树突细胞吞噬，迁移至代谢活跃的脂肪组织及血液中，以活菌形式导致发生炎症。同部位小肠中双歧杆菌数目明显减少。双歧杆菌可改糖代谢，增加胰岛素敏感性，提示双歧杆菌可阻止病原微生物的迁移和黏附，进而有效地改善胰岛素抵抗和治疗2型糖尿病。各组大鼠肾功能指标检查发现，与正常对照组相比，模型组Scr、BUN、24 h尿蛋白水平、ACR明显升高。上述指标都是临床检验中反映肾功能状态的有效生化指标，此结果表明诱导糖尿病模型时同时造成了肾功能受损。而双歧杆菌干预后Scr、BUN、24 h尿蛋白水平、ACR明显下降(P＜0.05)，但仍高于正常组。此结果表明，双歧杆菌干预后可以逆转受损肾脏功能，但这种功能修复并不完全可逆，但其机制上不明确。本研究结果表明2型糖尿病小鼠肠道菌群物种丰度显著下降，但增加双歧杆菌含量小鼠肠道菌群物种丰度与模型组比较并无明显差异。同时，2型糖尿病小鼠物种多样性与正常对照组小鼠比较没有显明显差异，但双歧杆菌含量增加后，小鼠肠道微生物物种多样性明显下降。这可能是因为双歧杆菌本身就占大部分，含量持续增加，导致其它物种的数量和活性减少，进而打破了多样性。

本研究结果表明，双歧杆菌可改善2型糖尿病小鼠糖代谢，增加肠道双歧杆菌的含量，逆转受损肾功能，但其能否成为辅助治疗糖尿病前期人群或高危人群的临床用药仍需进一步研究。