丹参注射液对模型兔骨折围手术期细胞因子TGF-β、TNF影响的实验研究*

李 鹏 冉祥根 尉继伟 赵志杰 刘轶韬

（山西大同大学附属医院，山西 大同 037005）

骨折愈合是外伤后骨组织、结构、功能的恢复过程，其间伴随着复杂而精细的生物学调节［1］。临床中，骨折患者其骨折愈合速度、有无并发症、伤肢有无血栓的形成等受到许多因素的影响，比如，细胞转化生长因子-β（TGF-β）是一种多功能细胞因子，在骨折愈合过程中，对细胞增殖、分化以及细胞外基质合成起重要调节作用［2-3］；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种多效性细胞因子，对骨折的预后也有一定的影响。因此，我们建立了兔四肢骨折的模型，进行围手术期检测模型兔血清中TGF-β、TNF-α的浓度变化，观察上述因子与骨折愈合的相关性，观察使用抗凝药物、活血化瘀类中药对于骨折术后愈合的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只健康雄性大白兔，体质量（5±0.5）kg，清洁级，批号：11804800013889，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供。按照国际实验动物科学理事会的指导方针进行，并获得大同大学动物实验伦理委员会的批准。

1.2 药物与试剂 低分子肝素钙，批号：20151122，规格：每支5000 IU，海南通用同盟药业有限公司提供。丹参注射液，批号17060224，规格10 mL×1支，生产厂家：成都天台山制药有限公司。检测试剂由北京北方生物技术研究所提供，使用科大创新股份有限公司GC-911γ放射免疫计数仪。内固定材料（掌骨钢板、螺丝钉），批号：1602920。规格：ZSZ07 5孔。江苏金鹿医疗器械有限公司提供。

1.3 造模与分组 自创试验动物模型。3%戊巴比妥钠30 mg/kg自耳缘静脉注入，麻醉显效后，将试验大白兔股骨干包纱布垫悬空固定于两款金属块之间，使用金属榔头敲击动物股骨干造成股骨干骨折，骨折类型为闭合性骨折，X线拍片明确骨折，随后对闭合性骨折模型的伤肢体进行简单外固定，避免加重损伤，模型制作成功待用。按随机数字表法分为低分子肝素钙组15只，丹参注射液组15只，模型对照组10只。伤后72 h内行内固定术。术前禁食12 h，3%戊巴比妥钠30 mg/kg自耳缘静脉注入，麻醉显效后，对伤肢体毛发进行剪切、脱毛剂处理；手术野皮肤消毒，逐层切开组织，显露骨折端，清除血肿，应用掌骨钢板行股骨干骨折切开复位内固定术；缝合伤口并包扎；术后X拍片复查骨折固定稳定。动物苏醒2～3 h后可自由进食。

1.4 给药方法 内固定手术后0.5 h，开始对低分子肝素钙组皮下注射低分子肝素钙，每次注射量为100 IU，每日1次，连用7 d。丹参注射液组术后0.5 h开始应用丹参注射液，1 mL肌肉注射，每日1次，连用7 d。模型对照组平行注射等量0.9%氯化钠注射液。

1.5 标本采集与检测 分别于术前1 d、术后24 h、术后72 h、术后7 d空腹状态下取外周静脉血，测定TGF-β、TNF-α。采用放射免疫法，测定方法均严格按照药盒说明书进行。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组一般情况 术后7 d各组实验动物均未出现伤肢肿胀和运动障碍。正常饮食，无动物死亡。

2.2 各组手术前后TGF-β水平比较 见表1。低分子肝素钙组术后TGF-β水平开始升高，术后1 d显著升高，高于模型对照组（P<0.01），术后7 d回落至最低，但较术前仍略有升高。丹参注射液组TGF-β水平变化趋势与低分子肝素钙组相同，但术后24、72 h较低分子肝素钙组升高更明显（P<0.01）。模型对照组TGF-β水平变化规律同其他两组，幅度明显为低。

表1 各组手术前后TGF-β 水平比较（ng/L，x±s）

2.3 各组手术前后TNF-α水平比较 见表2。低分子肝素钙组术后1 d TNF-α水平显著升高（P<0.01），术后3 d下降明显，术后7 d接近术前水平（较术前仍略高）。丹参注射液组TNF-α水平变化与低分子肝素钙组相同，但较低分子肝素钙组更明显（P<0.01），术后7d接近术前水平。模型对照组变化规律同实验组，幅度明显为低，术后7 d仍高。

表2 各组手术前后TNF-α 水平比较（ng/L，x±s）

3 讨 论

髋部及下肢骨折时深静脉血栓一直是重要并发症，严重影响生存和术后恢复；同时营养血管易受伤，导致骨折段供血不足，发生迟缓愈合或不愈合。用什么方法处理既能预防深静脉血栓形成又能促进骨折愈合，这是临床治疗中很有意义的一个课题。

3.1 关于深静脉血栓的处理 低分子肝素钙作为临床常用的抗凝药物多年来一直用于术后抗凝治疗，结合有效的预防措施，明显降低深静脉血栓并发肺栓塞的病死率，早期进行预防性治疗甚为重要。低分子肝素钙能刺激内皮细胞释放组织因子凝血途径抑制物和纤溶酶原活化物，不被第4因子中和，对血小板功能亦无明显影响；对血栓溶解有间接协同作用，可用于治疗已形成的深部静脉血栓［4］。在发挥抗栓作用时，出血的可能性较小。

在预防静脉血栓方面中医学有明显的优势，丹参是我国传统中药中的代表药，有良好的活血化瘀功效。以丹参注射液为干预因素预防深静脉血栓形成的作用，有效且安全地降低了血黏度，同时血清超氧化物歧化酶（SOD）活性升高、丙二醛（MDA）含量降低，提示丹参能减轻脂质过氧化反应及提高机体抗氧化能力，并减轻血管内皮细胞受损，因而可以推测，丹参可能正是通过提高机体抗氧化能力减轻脂质过氧化反应，达到保护血管内皮细胞的作用，从而起到预防深静脉血栓形成的作用［5］。

丹参多酚酸盐主要成分为丹参乙酸二钾、丹酚酸B镁等，不但具有活血化瘀功效，还对血小板聚集和纤维蛋白原具有抑制作用。另有研究证实，丹参多酚酸盐与低分子肝素钙比较，前者在改善下肢骨折术后肢体肿胀程度、沉重感、肢围差等方面更具优势。下肢骨折术后联合应用低分子肝素钙和丹参多酚酸盐，能够有效预防下肢深静脉血栓形成，值得临床推广应用［6］。丹参注射液预防治疗下肢深静脉血栓形成疗效显著，预防用药疗效明显优于治疗用药，而穴位用丹参注射液通过体表穴位吸收和经络传导，药效具有放大作用，这种放大作用可能是由于经络区域的导向性，能直接把药物送到相关组织中而提高了疗效［7］。

3.2 关于对细胞因子影响及骨折的愈合 TGF-β是一组广泛存在、功能相似、结构相关的多肽生长因子和有效的趋化因子，目前已经发现5种不同结构的TGF-β，在骨组织和血小板中有大量的TGF-β存在。骨折愈合中TGF-β的调控通路和作用机制进一步被认知，对促进骨折愈合有积极的意义。老年骨折为临床常见的骨折，多因骨质疏松导致髋部骨小梁结构改变，导致其TGF-β分泌能力的降低［8］。术后应用低分子肝素钙、丹参注射液可以预防深静脉血栓的发生率，但这些药物的使用是否可造成骨折不愈合或延迟愈合？本实验研究中发现：丹参注射液、低分子肝素钙抗凝治疗不仅可以预防深静脉血栓形成，对于围手术期术后细胞转化生长因子TGF-β的浓度升高具有一定的促进作用，应用丹参注射液组较应用低分子肝素钙组升高明显；同时实验动物均没有出现伤肢肿胀和运动障碍表现。研究认为［9］，丹参及其有效成分可以优化骨代谢过程，在女性骨质疏松以及骨折后愈合等方面均有积极作用。中医学认为丹参具有活血化瘀、清热解毒、凉血消肿的功效，较多国内外研究在对丹参的有效成分进行深入研究后发现，丹参可影响骨折愈合过程中的关键因子而发挥作用，在骨折早期及中期治疗中有促进骨折愈合的作用［10-11］。

丹酚酸B能促进新生大鼠成骨细胞增殖，成骨细胞上清液中骨钙素含量增加，且能促进成骨细胞生成矿化结节，说明丹酚酸B具有促进成骨细胞基质矿化的作用［12］。张晓等发现丹参注射液能促进人成骨细胞生成骨钙素，并使细胞内钙离子浓度升高，说明丹参能促进人成骨细胞成熟并提高其活性［13］。丹参注射液能促进骨折愈合过程中BMP-7、TGF-β及FGF生长因子的表达，且成骨细胞和破骨细胞数量均增多［14］。

TNF-α在诱导炎性细胞聚集、介导细胞死亡、增殖、迁移等方面有重要作用［15-16］；当机体受到创伤后，TNF-α是机体应激反应产生最早的、最核心的炎症介质，它在创伤后24 h达高峰，72 h可降至正常［17］。TNF-α对骨折修复过程具有双相调节作用。既往研究表明，TNF-α抑制新骨生成、刺激骨吸收。近年来随着对TNF-α的结构及作用机制的进一步研究，它在参与骨折修复方面的作用有了新的认识，TNF-α不仅可以促进破骨细胞的分化而且具有诱导成骨细胞形成促进成骨作用［18］。肝素应用于临床已有多年历史，目前许多研究证实肝素对TNF-α水平有抑制。丹参能显著抑制白细胞聚集，也可降低血清TNF-α［19］。我们在实验研究中发现在应用丹参注射液、低分子肝素钙抗凝治疗后，TNF-α的浓度升高受到明显的抑制作用，这与上述文献资料相近。

使用TGF-β治疗骨折是一前瞻性的研究，但必须解决TGF-β的毒性、免疫原性、所使用的剂型、剂量等因素。对于骨折是单用一种TGF-β还是联合应用其他生长因子如胰岛素样生长因子（IGF-I）等，同时如何抑制TNF-α升高，这些基础研究和临床应用研究的有机结合，中西医联合治疗的介入，相信TGF-β、IGF-I、TNF-α等细胞因子将会成为治疗难愈骨折和骨病的重要方法之一。