石甘散对戊四氮致痫大鼠氧化应激反应及Nrf2、HO-1因子影响的研究*

庞 博 张 韧 张 奇 王 轩 程为平△

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省中医科学院，黑龙江 哈尔滨150040）

癫痫是由多种病因导致的以脑部神经元过度同步化放电为特征的神经系统难治性疾病。癫痫发病机制复杂，其中因氧化应激导致的一系列反应是诱发癫痫乃至使病情进展的重要因素之一［1］，多余氧化应激产物氧自由基的生成可以直接破坏蛋白质等大分子、破坏细胞结构甚至引起细胞凋亡［2］。因此如何抑制癫痫发病后的氧化应激反应是治疗本病的关键。石甘散是由甘松、石菖蒲组成的抗癫痫基础方，临床应用疗效显著。本研究通过观察石甘散对戊四氮（PTZ）致痫大鼠海马神经元抗氧化应激活性物质及核因子E2相关因子2（Nrf2）抗氧化通路中关键因子Nrf2、血红素加氧酶1（HO-1）的影响，观察石甘散抗氧化应激的作用，为癫痫的临床治疗提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

120只清洁级雌性SD大鼠，体质量（200±20）g，购自黑龙江中医药大学动物实验中心，许可证号：2013A047，2014B008。饲养于SPF级动物实验室，湿度50%～60%，室温20～24℃。

1.2 实验药物

石甘散：由石菖蒲、甘松2味中药按1∶1比例配置而成。 石菖蒲（1 g/包，等于 6 g 饮片）、甘松（1 g/包，等于10 g饮片）均为中药配方颗粒 （江阴天江药业生产）。根据成人与大鼠体表面积比换算，临床中药饮片常用剂量取15 g，换算成每只鼠每千克体质量的药量为：甘松组1.56 g/kg、石菖蒲组1.56 g/kg、石甘散组3.13 g/kg。上述颗粒药物分别注入85℃蒸馏水，配成灌胃混悬液备用，质量浓度分别是：甘松0.16 g/mL、石菖蒲0.16 g/mL，石甘散0.32 g/mL。丙戊酸钠片：规格为0.2 g/片，产自山东仁和堂药业有限公司（批号：H19983059），以羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂公司）充分溶解，配成质量浓度为20 mg/mL的混悬灌胃液，4℃遮光保存。PTZ：购自美国Sigma公司（Sigma-P6500），于每次实验前 30 min，取 300 mg PTZ晶体，充分溶解于0.9%氯化钠溶液150 mL中，配置质量浓度为2 mg/mL的PTZ溶液。

1.3 试剂与仪器

超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：20160314）、丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20160221）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒（批号：20160302），均购自南京建成生物工程有限公司。BCA蛋白定量试剂盒（C300120160221）、超强 RIPA 裂解液 C2501、5XSDS loading Buffer（S0137）、Trizol（B0201）、Golden 1st cDNA Synthesis Kit（D0401）均购自 HaiGene 公司，鼠抗β-actin单克隆抗体（A00702）购自金斯瑞生物有限公司，兔抗-Nrf2 抗体（bs-1074R）、兔抗-Heme Oxygenase 1抗体（bs-2075R）购自博奥森生物科技公司。

1.4 造模与分组

将SD大鼠适应性饲养7 d，然后进行编号标记，按随机数字表法抽取15只作为空白组，余鼠进行癫痫模型点燃。 在每天上午 9∶00～10∶00，予 PTZ 溶液 35 mg/kg腹腔注射，空白组予等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射。每次注射后观察大鼠的行为变化，在造模周期28 d内，连续5次出现Ⅱ级或Ⅱ级以上痫性发作为造模成功。按照Racine［3］制定的分级法判定癫痫发作程度：0级为不出现抽搐；Ⅰ级为局部面部肌肉抽搐，如咀嚼、眨眼或湿狗样抖动等；Ⅱ级为有点头动作为主要表现的颈部肌肉痉挛；Ⅲ级为单侧前肢阵挛伴后肢无法站立；Ⅳ级为双前肢阵挛抽搐伴后肢站立；Ⅴ级为全面发作，肢体反弓强直、抽搐、跌倒。剔除在造模周期内未达到痫性发作等级要求和死亡的大鼠，将剩余造模成功大鼠随机分配到模型组、西药组、石菖蒲组、甘松组、石甘散组，每组12只。进行干预治疗后，除去死亡大鼠，空白组剩余11只、模型组10只、西药组11只、甘松组10只、石菖蒲组10只、石甘散组11只，其中每组随机选取5只取样用于氧化应激产物蛋白测定，其余大鼠取样进行Nrf2、HO-1因子的蛋白和mRNA测定。

1.5 干预方法

空白组和模型组给予0.9%氯化钠注射液（10 mg/kg）每日2次灌胃，西药组给予丙戊酸钠溶液灌胃（350mg/kg），12 h 1 次；甘松组（0.16 g/mL）、石菖蒲组（0.16 g/mL）、石甘散组（0.32 g/mL）均每日灌胃相应药液2次。所有组别均灌胃给药14 d。

1.6 标本采集与检测

末次给药结束后，以10%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，起效后固定大鼠，沿着腹中线剪开腹部，分离心脏和胸壁，使心脏位置充分暴露，在右心耳下剪一小口以引流并向左心室内快速灌注0.9%氯化钠注射液，之后以4%多聚甲醛溶液固定组织后将大鼠断头，经颅前正中线剪开头皮暴露颅骨，剪开枕骨，取脑组织于冰台上，迅速剥离海马及脑组织，马上置于液氮中随后转移至-80℃冰箱保存。1.6.1 氧化应激产物蛋白测定 将分离好的脑组织块置于预冷的4℃0.9%氯化钠溶液中浸洗，在冰浴下超声破碎制成10%脑组织匀浆液，4℃低温3000 r/min离心10 min，采用考马斯亮蓝检测法测定脑组织SOD、MDA、GSH蛋白含量。1.6.2 Western blotting测定海马组织Nrf2、HO-1蛋白表达 取海马组织，按说明书提取全细胞、胞核和胞质蛋白并测定蛋白含量。取蛋白样品，SDS-PAGE电泳分离，150 V电泳完毕后进行转膜，取转膜结束的NC膜至10 mL Western信号增强剂中孵育15 min，将NC膜转至封闭液5%脱脂奶粉中，室温封闭1 h后TBST洗1次 （5 min），按照说明书推荐比例将一抗加入至Western一抗稀释液中，混合均匀，4℃孵育过夜，TBST洗 3次 （每次 5 min）， 按 1∶5000比例将二抗加入Western二抗稀释液中，室温孵育30 min，二抗孵育结束后，TBST洗4次（每次5 min），超敏ECL显色液显影，以β-actin为内参照，化学发光成像系统成像，以目的条带的IOD值与β-actin条带的IOD值的比值作为该蛋白的相对表达量。1.6.3 PCR法测定海马组织 Nrf2、HO-1 mRNA表达取海马组织，以TRIzol法提取总RNA，反转录至cDNA。Nrf2基因引物，上游序列5′-AGCACAGCCAACA CATTCTTC-3′。 下游序列：5′-TTGATGACCAGGACTC ACAGG-3′。扩增片段：133bp。HO-1 基因引物，上游序列：5′-TGGAAGAGGAGATAGAGCGAAAC-3′。 下游序列：5′-TGTGTGGCTGGTGTGTAAGG′， 扩增片断 154 bp。 GAPDH 基因引物，上游序列：5′-AAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′。 下游序列：5′-TACTCAGCACCA GCATCACC-3′，扩增片段 119 bp。反应体系 20 μL，Nrf2、HO-1、GAPDH 的 PCR 扩增条件为：95 ℃，15 min、95℃，10 s、60℃，30 s，40个循环。 取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描，测定目的条带的光密度值（OD），目的条带OD值与GAPDH的OD比值代表目的基因表达强度。

1.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析以及显著性检验。方差齐时采用LSD法检验，方差不齐时进行转换后再重复如上分析。P<0.05表示差异显著，有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑组织氧化应激参数SOD、MDA、GSHPx含量比较 见表1。与空白组比较，模型组SOD、GSH-Px含量降低，MDA含量升高（均P<0.01），甘松组和石菖蒲组SOD、GSH-Px含量降低 （均P<0.01），MDA含量无统计学意义（P>0.05）；与模型组比较，各干预组SOD、GSH-Px含量均增加 （P<0.05或P<0.01），MDA 含量均降低（P<0.05）；与西药组比较，甘松、石菖蒲组 SOD、GSH-Px 明显降低（P<0.05），MDA无显著改变 （P>0.05）， 石甘散组 SOD、GSH-Px与MDA差异无统计学意义（P>0.05）；与甘松组、石菖蒲组比较，石甘散组 SOD、GSH-Px含量升高（P<0.05），MDA含量差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠脑组织氧化应激参数比较（x±s）

2.2 各组大鼠海马组织Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达比较 见表2、图1、图2。Western blotting检测蛋白表达结果：与空白组比较，其余各组的Nrf2、HO-1蛋白表达均增加（P<0.05或P<0.01）；与模型组比较，西药组、石甘散组的Nrf2、HO-1蛋白表达增加（P<0.05或P<0.01）；与西药组比较，甘松组和石菖蒲组蛋白表达明显下降（均P<0.01）；与甘松组和石菖蒲组比较：石甘散组Nrf2、HO-1蛋白表达显著增加 （P<0.05或P<0.01）。RT-PCR检测mRNA表达结果：与空白组比较，其余各组的Nrf2、HO-1 mRNA表达均增加（均P<0.05）；与模型组比较，西药组、甘松组、石菖蒲组和石甘散组的Nrf2、HO-1 mRNA表达增加 （均P<0.05）；与西药组比较，甘松组、石菖蒲组及石甘散组蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；与甘松组和石菖蒲组比较：石甘散组Nrf2、HO-1mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05），即西药组、甘松组、石菖蒲组及石甘散组之间Nrf2、HO-1mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨 论

研究证实，癫痫发作会通过多种途径导致神经细胞死亡，如兴奋性中毒引起线粒体功能障碍、氧化应激反应和一些迟发性细胞凋亡通路的激活等［4］。而氧化应激以及其引起的神经细胞死亡是诱发并导致癫痫反复发作的重要因素［5］。机制可能是过量生成的活性氧簇ROS增加了细胞间钙离子浓度进而导致脑部神经元的重塑、坏死和凋亡［6］。 SOD、GSH-Px 分别是存在人体内超氧化物还原酶和过氧化物分解酶，具有清除自由基、还原有毒过氧化物的作用；MDA是自由基作用于脂质发生氧化应激的终产物，具有细胞毒性。本研究表明：戊四氮造模后大鼠海马区域发生氧化应激损伤，SOD、GSH-Px降低，MDA升高，丙戊酸钠、甘松、石菖蒲和石甘散均能通过增加SOD、GSH-Px和降低MDA抑制氧化应激损伤，丙戊酸钠与石甘散抑制作用强于甘松、石菖蒲单独应用。此结果证实了甘松、石菖蒲具有抗氧化应激损伤、清除自由基作用，组合应用后效应增强，与丙戊酸钠比较无差异。

表2 各组大鼠海马组织Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达比较（±s）

表2 各组大鼠海马组织Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表达比较（±s）

组别 n空白组 6模型组 5西药组 6 Nrf2蛋白 HO-1蛋白 Nrf2 mRNA HO-1 mRNA 0.07±0.01 0.04±0.01 1.00±0.12 1.00±0.33 0.15±0.01* 0.11±0.02* 2.30±0.22* 2.97±0.42*1.00±0.30**## 1.00±0.17**## 5.85±0.57*# 5.53±0.65*#甘松组 5 0.28±0.03*△△ 0.33±0.17*△ 4.83±0.27*# 4.24±0.13*#石菖蒲组 5 0.19±0.02*△△ 0.18±0.08*△△ 4.22±0.22*# 415±0.53*#石甘散组 6 0.57±0.02*#☆★ 0.81±0.10**##☆★★ 5.04±0.46*# 5.28±0.14*#

图1 Nrf2蛋白电泳条带

图2 HO-1蛋白电泳条带

Nrf2是氧化还原敏感性转录因子，通过激活抗氧化应答因子ARE介导的相关因子起到保护细胞的作用［7］，ARE 介导的 HO-1 是此反应的关键抗氧化物酶［8］，正常状态下Nrf2与Keap1形成复合物存在于胞浆，氧化应激反应发生后，Nrf2与Keap1解离进入细胞核并与ARE结合，抗氧化酶基因开始表达，如HO-1、GSH等，从而增强了细胞对氧化应激损伤的抵抗性［9］。Nrf2/HO-1信号通路是氧化应激反应的重要细胞传感通路［10］，激活此通路可以对减少由高糖引起的细胞凋亡起到关键性作用［11］。既往研究证实了左乙拉西坦能够改善癫痫大鼠的认知功能，其机制可能是通过激活Nrf2-ARE通路，使HO-1、NQO1蛋白表达增多，起到抗癫痫的作用［12］。本研究表明，大鼠在戊四氮造模后，海马组织内Nrf2、HO-1蛋白表达和mRNA表达均增强，此现象为Nrf2/HO-1通路被进一步增强激活的标志。丙戊酸钠、甘松、石菖蒲及石甘散均可继续激活Nrf2/HO-1途径，增加Nrf2、HO-1蛋白合成及mRNA表达，起到抗氧化应激的保护作用。丙戊酸钠与石甘散对于Nrf2、HO-1蛋白表达强于单用甘松、石菖蒲，mRNA间表达无差异，提示石甘散对Nrf2/HO-1通路具有加强激活作用，与丙戊酸钠比较无差异。

石甘散是以甘松、石菖蒲为主要组方药物的临床经验处方。甘松有理气止痛、开郁醒脾的功效，可治疗胃痛、心悸、痫病等。甘松有效成分为甘松多糖，具有解痉、镇痛、抗细胞氧化、抗菌等作用。现代药理研究表明甘松多糖是具有强还原能力的天然抗氧化剂，能较好地清除羟基自由基、超氧阴离子自由基，发挥抗氧化活性［13］。丁莉等观察甘松合并丙戊酸钠治疗癫痫的临床疗效，证实其可以有效控制癫痫发作频次，减少脑电异常者人数，效果优于单独应用丙戊酸钠［14］。石菖蒲味辛，为宣气通窍、芳香行散之品，主治癫狂、厥证、健忘、神昏等。石菖蒲中有效成分挥发油（主要为β-细辛醚、α-细辛醚）具有镇静催眠、抗惊厥、抗痴呆、抗衰老、抗抑郁及降脂抑菌等作用。既往研究证实了石菖蒲挥发油中β-细辛醚可直接透过血脑屏障，明显延长士的宁惊厥小鼠的惊厥潜伏期，缩短惊厥持续时间，降低惊厥大鼠脑电图频率及波幅，能有效增加SOD含量，减少NO、Glu、Asp、Tau生成，起到抗氧化应激的神经保护作用［15］。

本研究证实了石甘散及其主要组成甘松、石菖蒲均具有抗癫痫大鼠氧化应激损伤、清除自由基的作用，其起效机制可能是通过进一步激活Nrf2/HO-1通路，促进抗氧化应激因子Nrf2及下游基因HO-1生成有关。本研究治疗周期为14 d，属于针对慢性癫痫点燃模型的研究，有研究证实非药物干预下，Nrf2自身在急性癫痫模型（24 h）表达上调，具有抗氧化作用，进而保护神经元［16］，后续研究应重点观察在此基础上缩短及延长治疗时间后其抗氧化应激效应的改变。