超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋氟喹诺酮类药物残留的不确定度分析

吾建祥，杨德毅，虞 冰，马婧妤，李晓敏，刁银军

（1.浙江省金华市农产品质量综合监督检测中心，浙江 金华 321017；2.金华职业技术学院，浙江 金华 321017）

氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones，FQs） 是以喹诺酮母核结构为基础，在其母核上进行结构修饰，在喹诺酮结构的6位上添加氟原子，在7位上引入哌嗪环或其他衍生物后构成的新一代喹诺酮类药物。氟喹诺酮类药物具有抗菌谱广且作用强的特点，广泛应用于人和动物的疾病治疗[1～3]。研究表明，FQs可能会对人体的中枢神经系统和心血管系统造成不良反应，使用FQs抗生素会在动物的细胞或组织中残留，同时，FQs抗生素残留物进入土壤后，可通过食物链传播，引起人类不良反应的发生，影响身体健康[4～6]。而且，动物性食品中较低浓度的FQs残留容易引起耐药性菌株的产生，致使该类药物的有效使用剂量增加。FQs的残留问题已引起各国的广泛关注，我国以及CAC（国际食品法典委员会）、欧盟、美国、日本等国家或组织已将氟喹诺酮类药物列入限制使用的兽药药物名单中，并制订出相关的最高残留限量（MRL）[7～9]，而且，我国已经制定了有关检测标准。

评定测量结果的不确定度可以保证检测结果更加公正、准确。同时，通过不确定度评定可以判定测量结果质量的高低，因此，不确定度的评定也是实验室质量体系的重要部分[10]。依据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》和JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》等[10～12]相关规定，建立超高效液相色谱-串联质谱测定禽蛋中氟喹诺酮类药物残留量的方法，对测定结果的不确定度进行评价及分析，旨为禽蛋品质评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

禽蛋。购自金华市各大超市。

试剂。达氟沙星标准品（纯度94.90%，北京振翔科技有限公司）、恩诺沙星标准品（纯度99.90%，北京振翔科技有限公司）、无水硫酸钠和正己烷，为分析纯；乙腈和甲酸，为色谱纯。

仪器。LC-MS/MS8050超高效液相色谱-串联质谱仪（日本岛津），BSA2202S电子天平（德国赛多利斯），BSA224S电子天平（德国赛多利斯），高速离心机（日本日立），涡旋振荡器（德国IKA），氮吹仪（Organomation），调速多用振荡器（金坛盛蓝），台式离心机（上海安亭）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 称取样品（已匀浆） 2.00 g于5 mL离心管中，加入无水硫酸钠2 g。加入酸化乙腈（1%甲酸）溶液4 mL，涡旋混匀，超声3 min，4℃条件下4 000 r/min离心5 min，将上层液转移至50 mL离心管中，4 mL酸化乙腈重复提取1次，合并至离心管。提取液中加入乙腈饱和正己烷溶液10 mL，震荡5 min，弃去上层溶液，重复净化1次。氮气吹干。准确加入乙腈1 mL溶解，超声，涡旋混匀；再加入水1 mL，超声，涡旋混匀；然后，转移至5 mL离心管，4℃条件下10 000 r/min离心5 min，过0.22 μm滤膜，上机测定。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：Shim-pack GISS 2.1 mm×100 mm，1.9 μm，C18；流动相：A相为0.2%甲酸水溶液，B相为乙腈/甲醇（体积比6∶4）；流速：0.4 mL/min；柱温：40℃；进样量：1 μL；洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为10%。

1.2.3 质谱条件 分析仪器：LC-MS/MS-8050；源温度：300℃；离子化模式：ESI（+）；DL温度：250℃；加热气：空气10.0 L/min；加热模块温度：400℃；雾化气：氮气3.0 L/min；扫描模式：多反应监测（MRM）；干燥气：氮气10.0 L/min；延迟时间：3 min；碰撞气：氩气。达氟沙星和恩诺沙星质谱MRM方式检测的部分参数不同（表1）。

表1 质谱MRM方式检测的部分参数Table 1 Some parameters detected by MRM

1.3 结果计算与表述

根据公式，计算氟喹诺酮类药物的残留量：

式中，X为样品中待测组分的含量（μg/kg），C为测定液中待测组分的浓度（ng/mL），V为定容体积（mL），m为样品称样量（g）。

1.4 不确定度分析

不确定度来源主要包括三大类：标准溶液配制引入的不确定度，标准拟合曲线引入的不确定度，样品测定引入的不确定度（表2）。

2 结果与分析

2.1 标准溶液配制引入的不确定度（Urel(ss)）

称取达氟沙星、恩诺沙星标准品各10.00 mg，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容溶解，得到其1 mg/mL的标准溶液。各吸1mL（1mg/mL） 至25 mL容量瓶中，得40μg/mL氟喹诺酮类混标溶液；吸2.5mL上述溶液至10mL容量瓶，得10μg/mL氟喹诺酮混标溶液；再吸上步溶液1 mL至10 mL容量瓶，得1μg/mL氟喹诺酮类混标溶液；再吸上步溶液1 mL至10 mL容量瓶，得100 ng/mL氟喹诺酮类混标溶液。

表2 不确定度的来源Table 2 Source of uncertainty

2.1.1 标准品纯度引入的不确定度（Urel(sp)）根据均匀分布，达氟沙星和恩诺沙量标准品纯度引入的相对不确定度为：

式中，C为标准品的纯度。

2.1.2 标准品定容引入的不确定度（Urel(sm)）根据JJG 1306－2008《电子天平检定规程》，天平允许的最大误差为±0.05 mg，准确称取达氟沙星、恩诺沙星标准品10.00 mg，按矩形分布，引入的相对不确定度均为：

根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》10 mL容量瓶（A） 级容量允差为±0.02 mL，按矩形分布，引入相对不确定度为：

甲醇的体积膨胀系数为0.001 1，实验室室温在±3℃之间变动，按照均匀分布，溶液因温度变化引入的相对不确定度为：

标准溶液配制引入的相对不确定度为：

2.2 标准拟合曲线引入的不确定度（Urel(sr）)

2.2.1 标准系列溶液的配制引入的不确定度（Urel(sc)）使用A级10mL吸量管分别准确量取2、5、8和10mL，使用A级20mL吸量管量取20mL标准溶液，使用A级50mL吸量管量取50mL标准溶液；置于A级100mL单标容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度线，依次得到溶液浓度为2、5、8、10、20和50 ng/mL的标准系列溶液。

根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》A级100 mL单标容量瓶容量允差为±0.02 mL，按矩形分布，引入的相对不确定度为：

根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》A级10 mL吸量管容量允差为±0.02 mL，按矩形分布，引入的相对不确定度为：

根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》A级20 mL移液管容量允差为±0.02 mL，按矩形分布，引入的相对不确定度为：

根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》A级50 mL移液管容量允差为±0.02 mL，按矩形分布，引入的相对不确定度为：

甲醇的体积膨胀系数为0.001 1，实验室室温在±3℃之间变动，按照均匀分布，溶液因温度变化引入的相对不确定度为：

标准系列溶液配制引入的相对不确定度为：

2.2.2 拟合曲线引入的不确定度（Urel(mc)）取以上对应质量浓度为2、5、8、10、20和50 ng/mL的6种标准系列溶液各1 μL分别测定，测定结果见表3。

式中，SR为标准溶液峰面积残差的标准差，p为试样平行测量次数，n为拟合曲线的数据总数，C平为标准溶液的平均质量浓度，C0为待测样品溶液按回归方程计算得到的浓度平均值。其中，SR的计算方法为：

其中，a为斜率，b为截距，n为测定次数，本试验中6个质量浓度依次测定，n=6；样品平行测定次数p=3。

经过计算，得到拟合标准曲线引入的相对不确定度为：Urel(mc达)=0.089 14；Urel(mc恩)=0.023 83。

标准拟合曲线引入的相对不确定度为：

2.3 样品测定引入的不确定度（Urel(ys)）

2.3.1 样品溶液配制引入的不确定度（Urel(yr)）准确称取样品（已匀浆）2.00 g，用乙腈溶解。

根据JJG 1306－2008《电子天平检定规程》，天平允许的最大误差为±0.05 mg，准确称取2种禽蛋样品，按矩形分布，引入的相对不确定度为

表3 拟合曲线引入的不确定度Table 3 Uncertainty caused by fitting curve

乙腈的体积膨胀系数为0.001 37，实验室室温在±3℃之间变动，按照均匀分布，溶液因温度变化引入的相对不确定度为：

样品溶液配制引入的相对不确定度为：

2.3.2 仪器进样引入的不确定度（Urel(yv)）样品上机进样量为1 μL，微量注射器体积的相对标准偏差（RSD）为±1%，符合对称分布，则仪器进样体积引入的相对不确定度为：

2.3.3 样品测定重复性引入的不确定度（Urel(yc)）将重复测定的平均含量（C）、相对标准偏差（RSDc）结果（表4） 分别代入公式和Urel(yc)=Uyc/C，得到样品重复测量引入的相对不确定度为：Urel(yc达)=0.006 94，Urel(yc恩)=0.008 807。

表4 样品测定重复性引入的不确定度Table 4 Uncertainty caused by repeatability of sample determination

2.3.4 样品添加回收引入的不确定度（Urel(ya）)重复性试验中达氟沙星、恩诺沙星的平均回收率（a）依次为86.67%、89.75%，将平均回收率（a）、相对标准偏差 （RS D）a结果（表5） 分别代入公式和Urel(ya)=Uya/a，计算得到回收率引入的相对不确定度为：Urel(ya达)=0.034 70，Urel(ya恩)=0.044 02。

样品测定引入的不确定度为：

表5 鸡蛋中氟喹诺酮类药物后来的测定结果Table 5 The determination results of fluoroquinolones in eggs

2.4 相对合成不确定度的分析

计算公式为：

根据测定过程中各项不确度结果（表6），利用公式计算得到达氟沙星、恩诺沙星的相对合成不确度分别为0.100 5和0.051 25。

表6 合成不确定度的分析Table 6 Analysis on the synthetic uncertainty

2.5 扩展不确定度及结果表示

依据JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》相关规定，置信区间为95%，包含因子k=2，LC-MS/MS法测定禽蛋氟喹诺酮类含量的扩展不确定度U=Urel×2×X（X指样品含量平均值），由此得到LC-MS/MS法测定禽蛋氟喹诺酮类药物含量的结果（表 7）。

表7 扩展不确定度的分析Table 7 Analysis on the expanded uncertainty

3 结论与讨论

采用LC-MS/MS方法测定禽蛋氟喹诺酮类含量时产生不确定度的因素主要由三大部分组成，分别为标准溶液配制、标准拟合曲线、样品测定（图1）。其中，添加回收引入的不确定度对恩诺沙星的影响最大，标准曲线拟合引入的不确定度对达氟沙星的影响最大。仪器进样、样品溶液配置、标准系列溶液的配置对这2种物质影响均不大。

图1 禽蛋中氟喹诺酮类药物残留的不确定度分析Fig.1 Uncertainty analysis of fluoroquinolones residues in poultry eggs