黑粒小麦资源的籽粒淀粉组分和SGP-1蛋白组成研究

孟雅宁，王恰恰，张业伦，兰素缺，李光威，李杏普，古东月

（1.河北省农林科学院粮油作物研究所，农业部河北作物基因资源与种质创制科学观测实验站，河北省作物遗传育种实验室，河北石家庄 050035；2.河北省农林科学院经济作物研究所，河北 石家庄 050051；3.馆陶县农牧局，河北 馆陶 057750）

随着经济的迅速发展和人民生活水平的日益提高，人们的生活方式与饮食习惯也正经历着前所未有的变革。近年来，与饮食相关的疾病如冠心病、癌症（尤其是直肠癌和结肠癌）和糖尿病等，成为中老年人群发病和死亡的主要原因，且呈现出低龄化趋势。2006年中国学生营养与健康促进会发布的《中国学龄儿童少年营养与健康状况调查报告》显示，在包括血压、体重指数、糖耐量和血脂等一系列代谢指标的“代谢综合征”检测中，有64.1%的孩子至少有1项指标异常。

大量医学研究证明，抗性淀粉（RS）具有良好的营养特性和生理功能[1～3]。在日常饮食中增加抗性淀粉的摄入，可减缓碳水化合物的吸收速度，具有控制体重、维持餐后血糖稳态、预防便秘和结（直）肠癌、降低血脂等生理功能。RS主要是由小部分的糊精和大部分的直链淀粉回生后聚合而成。直链淀粉是形成抗性淀粉最重要的组分。然而，调查发现，目前主推小麦品种中直链淀粉含量仅占胚乳淀粉含量的12%～35%，而支链淀粉含量比例高达65%～88%[4～7]。目前，对于高直链淀粉品种的选育和遗传研究严重不足。小麦是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，也是我国北方居民的传统主食作物。提高我国小麦直链淀粉含量，增加饮食中的抗性淀粉含量，对于全面改善公众健康水平十分重要。

淀粉颗粒蛋白SGP-1（包含3个亚基SGP-A1、SGP-B1和SGP-D1）缺失可引发淀粉等品质性状发生改变，提高直链淀粉的相对含量。Yamamori等[8]利用SGP-A1、SGP-B1和SGP-D1 3个单缺失材料，杂交聚合获得SGP-1三缺失材料，发现胚乳中短支链淀粉含量显著增加，直链淀粉含量升高。以冀紫439等43份黑粒小麦资源为试材，开展小麦籽粒SGP-1缺失资源的鉴定及其直链淀粉和抗性淀粉含量的研究，可为高直链淀粉和高抗性淀粉小麦分子育种材料的筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黑粒小麦资源共43份，包含国内黑小麦农家种及育成种8个，均由河北省农林科学院粮油作物研究所小麦资源室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 SGP-1蛋白鉴定 SGP-1蛋白提取参照Yamamori M等[9]方法，SDS-PAGE电泳参照汪家政[10]的方法。具体步骤为：

（1）取混合均匀的全麦粉30 mg，加入0.6 mL淀粉漂洗缓冲液（55 m MTris-HCl，pH值6.8，2.3%SDS，5% β-巯基乙醇），在4℃条件下静置过夜，13 000 r/min离心4 min；

（2）去上清液后加入1 mL淀粉漂洗缓冲液，充分搅拌，13 000 r/min离心4 min，去上清液，重复步骤（2） 3次；

（3）用1 mL双蒸水代替淀粉漂洗液按步骤（2）漂洗2次；

（4） 加入0.6 mL提取缓冲液（淀粉漂洗缓冲液中加入10%甘油），悬浮，沸水浴（90℃） 5～10 min，后趁热离心10～15 min，取上清液上样电泳；

（5）分离胶浓度为10%，初始电压130 V，待溴酚蓝进入分离胶后加大电压至300 V电泳，电泳6 h；

（6）用银染法染胶。

1.2.2 淀粉组分含量测定

1.2.2.1 直链、支链淀粉含量测定。直链、支链淀粉标准曲线制作及其含量测定参照汪连爱[11]方法，直链淀粉和支链淀粉标准溶液分别由马铃薯直链、支链淀粉纯品（Sigma公司生产）制备。直链淀粉和支链淀粉的测定波长分别选定为630 nm和560 nm，参比波长分别选定为470 nm和730 nm。根据100 mg面粉测得的直链淀粉和支链淀粉质量计算面粉中直链淀粉、支链淀粉及总淀粉的含量，以及淀粉中直链淀粉和支链淀粉的相对含量。

1.2.2.2 抗性淀粉含量测定。参照爱尔兰Megazyme公司提供的方法测定。准确称取（10±0.05） mg样品，加入10 mg/mL胰α-淀粉酶＋3 IU/mL AGM混合工作溶液，于37℃水浴摇床中孵育16 h，用葡萄糖检测试剂盒在波长510 nm分光光度计下测定吸光值，并计算抗性淀粉含量。

2 结果与分析

2.1 黑粒小麦资源缺失SGP-1分子鉴定

利用SDS-PAGE电泳检测方法，对43份不同来源的黑粒小麦材料进行SGP-1蛋白鉴定。结果鉴定出缺失SGP-A1材料11份，分别为PURPLES556（MEX）、13075 （AUS）、II-66-561-3-6、6274（AUS）、6280（AUS）、汤河1号、黑小麦76、黑初8、冀紫439、黑初2和黑初27；未鉴定出SGP-B1和SGP-D1缺失材料（表1）。其中，黑初8、冀紫439、黑初2和黑初27的株高和熟期等农艺性状与当前推广种接近。

2.2 黑粒小麦资源的籽粒淀粉组分

对43份黑粒小麦资源的淀粉组分含量进行测定，结果显示，11份SGP-A1缺失材料中，直链淀粉含量占总淀粉含量的比例超过30%的材料有5份，分别为黑初8、黑小麦76、黑初2、黑初27和冀紫439，占SGPA1缺失材料总数的45.45%；而其余的32份含有SGPA1材料中，直链淀粉含量占总淀粉量的比例超过30%的材料仅2份，分别为兰粒D87063和14928（AUS），占含SGP-A1材料总数的6.25%。由此可见，在黑粒小麦资源中，从SGP-A1缺失材料获得高直链淀粉含量的概率更大。

共对12份材料进行了抗性淀粉含量检测，结果（表2）显示，5份黑粒小麦材料（冀紫439、黑初8、黑初27、黑初2和兰粒D87063）的抗性淀粉含量＞10%，显著高于其他材料。

表1 43份黑粒小麦材料的SGP-1缺失情况及其淀粉含量Table 1 The composition of SGP-1 and starch content of 43 black wheat germplasms

3 结论与讨论

小麦SGP-1突变缺失会直接导致胚乳中淀粉组分发生改变[8]。相关研究表明，SGP-1缺失增加了短链支链淀粉含量，而短链支链淀粉含量表现出直链淀粉的特性，从而在表型上直链淀粉含量因SGP-1缺失而增加，即表观直链淀粉含量升高[8]。这种情况也出现在了高直链淀粉的玉米中[12]。在本研究的43份黑粒小麦资源中，45.45%的SGP-A1缺失材料直链淀粉含量占总淀粉含量的比例高于30%；而普通材料中，仅有6.25%的材料高直链淀粉含量占总淀粉含量的比例超过30%。该规律与前人研究结果相一致。

表2 12份不同材料的抗性淀粉含量Table 2 The resistant starch content of 12 black wheat germplasms

从供试的43份黑粒小麦资源中共鉴定出缺失SGP-A1材料11份，无缺失SGP-B1和SGP-D1材料，为小麦高附加值育种奠定了物质基础；直链淀粉含量占淀粉总量的比例超过30%的材料有7份，其中，农艺性状比较好的材料有黑初8、黑初2和黑初27等；选择12份材料进行抗性淀粉含量测定，发现高抗性淀粉含量的材料有5份，分别为冀紫439、黑初8、黑初27、黑初2和兰粒D87063。