细叶石仙桃乙醇提取物抗氧化活性研究

李培源，彭炳华，莫媛媛

(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530001；2.广西师范学院 化学与材料学院，广西 南宁 530001；3.广西南宁市第五十六中学，广西 南宁 530001)

活性氧(ROS)是许多氧化还原过程中产生的主要自由基，它可能对生物分子(包括碳水化合物、蛋白质、脂类和DNA)产生氧化损伤。活性氧影响活细胞是许多慢性疾病的发病机制，如动脉粥样硬化、帕金森病、阿尔茨海默病、中风、关节炎、慢性炎症性疾病、癌症和其他退行性疾病[1-3]。由于合成的抗氧化剂副作用多且有致癌风险，近年来科研工作者致力于寻找来源于植物的天然抗氧化剂[4-5]。细叶石仙桃(Pholidota cantonensis Rolfe)是兰科石仙桃属植物，根状茎匍匐，分枝，产浙江、江西、福建、台湾、湖南、广东和广西。《滇药录》：全草(假鳞茎)治疮疖红肿疼痛，火灼伤。《彝药志》全草治骨折，关节脱位。细叶石仙桃作为一种常用的草药，其抗氧化方面的研究未见报道。本实验通过冷浸法得到细叶石仙桃乙醇提取物，采用ABTS体系和还原能力体系，来评估其抗氧化能力，寻找新的天然抗氧化剂。

1 材料与仪器

UV1901型紫外可见分光光度计(北京普析电子科技有限公司)。药材购于广西百色，经鉴定为兰科石仙桃属植物细叶石仙桃(Pholidota cantonensis Rolfe)。芦丁标准品购于百灵威试剂公司(北京)。所有试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 细叶石仙桃乙醇提取物制备

称取20 g细叶石仙桃粉末，加入200 mL乙醇(95%)，冷浸72 h。重复上述操作3次，合并提取液。旋转蒸发回收溶剂，得到细叶石仙桃乙醇提取物。

2.2 ABTS·+自由基清除能力测定

将2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)用蒸馏水配制成2 mmol/L溶液，取50 mL上述溶液与200 mL K2S2O8水溶液(70 mmol/L)混合均匀，避光放置12～16 h，得到ABTS·+溶液。用磷酸盐缓冲液将ABTS·+溶液稀释至吸光度为0.70±0.02(Abs=734 nm处)。将细叶石仙桃提取物用95%乙醇稀释为7个不同浓度药液，取一定量提取物药液，加入1.9 mL ABTS·+溶液混匀，在1、3、5、10min时测其吸光度。ABTS·+自由基清除率(S%)计算公式如下：S=(A0-A)/A0，其中A0为ABTS·+溶液的吸光度，A为加药液后的吸光度。

2.3 还原能力测定[5]

取细叶石仙桃乙醇提取物溶液0.2 mL，加入2.5 mL PBS溶液(pH值=7.4)，2.5 mL KFe(CN)4(1%)。上述混合物于50℃恒温20min后，加入2.5 mL三氯乙酸溶液(10%)，离心10min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水，0.5 ml FeCl3(1%)，混匀。在700 nm处测定吸光度，以蒸馏水为参比。

2.4 总酚含量测定

2.4.1 Folin-Ciocalteu试剂的配制

称取80 g钨酸钠和20 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用560 mL蒸馏水溶解，加入40 mL磷酸溶液(85%)和80 mL浓盐酸，文火回流10 h，然后加入12 g硫酸锂及60 mL双氧水，加热沸腾15min至溶液呈亮黄色。冷却，移入1000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，贮于棕色瓶中。

2.4.2 总酚标准曲线绘制

精确称取没食子酸标准品25 mg，用蒸馏水溶解并定容到250 mL，得到0.1 mg/mL的对照品标准溶液。精密吸取对照样品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL Folin-Ciocalteau试剂，摇匀后加入3 mL 2% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容到10 mL，室温下反应2 h后在760 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，推出回归方程。

2.4.3 提取液中总酚含量的测定

将各提取物溶液测定吸光度，多次测量求平均值。根据回归方程计算总酚的没食子酸当量，总酚含量以每克干物质的没食子酸当量(mg)表示。

3 结果

3.1 细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS自由基的清除能力

3.1.1 不同浓度提取物对ABTS自由基的清除能力

图1为细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS自由基的清除能力测定结果。在浓度为0.5 mg/mL时，提取物对ABTS自由基的清除率为44.7%，浓度增加到0.8和1.0 mg/mL时，清除率增加至64.0%和82.5%。当浓度增加至2.0 mg/mL时，清除率增大到98.9%。可见，随着药液浓度增加，提取物对ABTS自由基的清除率增大。值得一提的是，在低浓度(0.2 mg/mL)时，细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS自由基表现出了一定的清除能力，清除率为23.3%。

图1 不同浓度细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS 自由基的清除能力

3.1.2 不同时间下提取物对ABTS自由基的清除能力

图2 不同时间细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS 自由基的清除能力

图2列出了不同时间细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS自由基的清除率。可见，随着作用时间增加，细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS自由基的清除率增加。浓度为1.5 mg/mL的提取物，在1min时的清除率为75.0%，在3和5min时清除率增加为85.0%和89.0%，在10min时ABTS自由基的清除率增加至94.9%。

3.1.3 细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS自由基的EC50值

EC50代表抗氧化剂对自由基达到半抑制时的质量浓度。EC50的数值越大，则表明抗氧化剂对自由基的清除能力越强。细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS自由基的EC50值为0.58 mg/mL，表明该提取物对于ABTS自由基的清除能力很强。

3.2 细叶石仙桃乙醇提取物的还原能力

图3表示细叶石仙桃乙醇提取物的还原能力，测定结果以吸光度表示，吸光度越高表示还原能力越强。细叶石仙桃乙醇提取物的还原能力与药液浓度有关，药液浓度越高，提取物的还原能力越强。药液浓度为0.2 mg/mL时吸光度为0.19，浓度为0.5和0.8 mg/mL时吸光度为0.29和0.42，浓度增加至1.2 mg/mL时吸光度增大到0.54和0.63。浓度为2.0 mg/mL时吸光度达到了0.72，表明石仙桃乙醇提取物具有很好的还原能力。

图3 细叶石仙桃乙醇提取物的还原能力

3.3 细叶石仙桃乙醇提取物的总酚含量测定结果

通过总酚含量测定实验发现，细叶石仙桃乙醇提取物的总酚含量为39.7 mg/g，具有较高的总酚含量。结果表明，细叶石仙桃乙醇提取物优良的ABTS·+自由基的清除能力和还原能力可能与其高含量酚类物质有关。

4 结论

本实验通过冷浸法得到细叶石仙桃乙醇提取物，采用ABTS和还原能力体系来评估其抗氧化能力，并测定其总酚含量，探索细叶石仙桃乙醇提取物总酚含量和其抗氧化能力之间的关系。结果表明，细叶石仙桃乙醇提取物对ABTS自由基表现出较强的清除能力，在浓度为2.0 mg/ml时清除率为98.9%。该清除率与细叶石仙桃乙醇提取物的浓度和作用时间有关，浓度越大，作用时间越长，则提取物对ABTS自由基提取物对ABTS自由基的清除率越高。细叶石仙桃乙醇提取物具有较高的总酚含量，表明其良好的抗氧化能力可能与其高含量酚类物质有关。