紫草三黄栓抗炎作用机制及急性毒性研究

万凯华， 赵 媛， 焦 敏， 李 敏， 宋志鹏， 李 岩， 翁幼武

(1新疆医科大学药学院药剂物化教研室， 乌鲁木齐 830011； 2乌鲁木齐市中医医院药剂科， 乌鲁木齐 830000)

关健词： 紫草三黄栓； 抗炎机制； 急毒实验

痔疮是一种常见多发病，不同年龄与不同性别的人群皆有患病的可能性，故常有“十人九痔”之说[1]。痔疮类型分3种：内痔是肛垫的支持结构、静脉丛及动静脉吻合支发生病理性改变或移位；外痔是齿状线远测皮下静脉丛的病理性扩张或血栓形成；内痔通过丰富的静脉丛吻合支和相应部位的外痔相互吻合融合为混合痔[2]。紫草三黄栓为乌鲁木齐市中医院院内制剂，由紫草、黄连、黄柏等多味药材组成，具有清热燥湿、消肿止痛、凉血止血、生肌敛疮、软化瘢痕的功效，在治疗肛肠疾病特别是痔疮方面疗效较好[3,4]。本课题组前期对紫草三黄栓的抗炎作用进行了研究[5],本研究采用大鼠足肿胀和气囊炎2种模型探究紫草三黄栓的抗炎作用机制，经小鼠急性毒性实验考察紫草三黄栓的毒性作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1试药紫草三黄栓浓缩浸膏粉由乌鲁木齐市中医医院药研室自制(批号20160120)，马应龙麝香痔疮栓(武汉马应龙药业集团股份有限公司，批号171011)，角叉菜胶(上海源叶生物科技有限公司，批号YY13755)，蛋白(南京建成生物工程研究所，批号20180426)，一氧化氮(南京建成生物工程研究所，批号20180428)，超氧化歧化酶(南京建成生物工程研究所，批号20180425)，丙二醛(南京建成生物工程研究所，批号20180427) ，前列腺素E2(南京建成生物工程研究所，批号11/2018)，环氧合酶-1(南京建成生物工程研究所，批号11/2018)，环氧合酶-2(南京建成生物工程研究所，批号11/2018)。

1.2仪器BS110S型分析天平(北京赛多利斯天平有限公司),DY15K型电子天平(上海菁海仪器有限公司), SF-TDL-5C型台式低速离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司),Multiskan GO型全波长酶标仪(赛默飞世尔科技公司)，FSH-2A型可调高速匀浆机(金坛市医疗仪器厂)，XSZ-HS7型生物显微镜(重庆光电仪器有限公司)。

1.3实验动物SPF级昆明种小鼠，体质量(20±2)g，雌雄兼用；SPF级 Wistar大鼠,体质量分别为(140±10)g与(250±50) g，雄性，均由新疆医科大学实验动物中心提供，使用许可证编号为:SYXK(新)2016-0002。

1.4实验方法

1.4.1 炎症组织中PGE2、MDA、NO、蛋白含量和SOD活力测定 雄性Wistar大鼠50只，体质量(140±10)g，随机分为5组，每组l0只，分别为空白组(蒸馏水)，实验组(紫草三黄栓低、中、高剂量0.91、1.81、3.62 g/kg体质量)、对照组(马应龙麝香痔疮栓0.32 g/kg体质量)。直肠给药连续7 d，1次/d。末次给药30 min后每只大鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1 mL致炎，注射时先自足跖中部皮下向上注入0.05 mL，然后调转针头向下注射剩余0.05 mL。6 h后颈椎脱臼处死大鼠，将致炎足自踝关节下0.5 cm处剪下，剥皮，在冰生理盐水中反复漂洗除去血液，滤纸擦干，称重。剪碎致炎足，加入9倍量的生理盐水作为匀浆介质，倒入匀浆管中10 000～15 000 r/min机械匀浆，制成10%组织匀浆液，3 000 r/min离心15 min，将离心好的匀浆取上清液置于4 ℃保存，用于测定PGE2、MDA、NO、蛋白含量和SOD的活性。

1.4.2 对大鼠气囊炎模型气囊渗出液中白细胞个数的影响 取体质量(250±50) g 的雄性Wistar大鼠50只，按“1.4.1”项下方法分组及给药，第1 d给药前用10%水合氯醛麻醉大鼠，在背部肩胛区将鼠毛剃除干净，并用75%乙醇消毒皮肤。备皮部位皮下无菌注入经0.2 mm过滤器滤过的空气20 mL形成气囊，并在第3、6 d再次分别补充注射空气10 mL维持气囊膨胀，第6 d注射空气后再在气囊内注入1%角叉菜胶2 mL诱发炎症，对照组注入相等体积生理盐水。注射完毕后立即将鼠背向下反复摇晃以使致炎剂充分均匀接触囊壁组织发生炎症反应。在致炎24 h后的急性炎症期麻醉，腹主动脉取血后脱颈处死大鼠。用75%乙醇消毒背部皮肤，剪开气囊，向气囊内注入冰生理盐水(含肝素50 U/mL) 4 mL充分灌洗气囊内壁，收集灌洗液并准确计量其体积(大鼠气囊渗出液量=灌洗液量-4 mL)。收集到的灌洗液2 000 r/min离心10 min，沉淀用5 mL生理盐水重悬后加入2 mL白细胞稀释液，吸取0.01 mL稀释后的灌洗液放入白细胞计数板中,于生物显微镜下计数。

1.4.3 紫草三黄栓对COX-1、COX-2的抑制作用 将“1.4.2”项下采集的大鼠动脉血液放置1 h后，3 000 r/min离心10 min，收集上层血清按照COX-1、COX-2酶联免疫检测试剂盒说明书方法测定大鼠血清中炎症因子的含量。

1.4.4 急性毒性实验 预实验时以最大给药浓度(0.955 g/mL)、给药体积(0.02 mL)，每天给药2次后，小鼠无死亡现象，故正式试验以此方案进行直肠给药试验。取昆明种小鼠50只，雌雌各半，体质量(20.0±2.0)g,随机分为空白组(蒸馏水)、实验组(19.1 g/kg)，每组25只。给药后将小鼠常规饲养2 w，逐日观察记录小鼠表现是否存在异常。观察的指标包括一般指标(动物外观、行为、分泌物、排泄物等)、动物体质量变化(给药前、给药1 w后、试验结束处死动物前各称重1次) 、中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)、动物死亡情况(死亡时间、濒死前反应)，并在此期间记录小鼠死亡只数。在实验第8 d和第15 d称取小鼠体质量，比较给药前后小鼠的体质量变化情况。若有中毒死亡或中毒表现明显者，需作解剖检查，尸检异常的组织器官做组织病理学检查。第15 d颈椎脱臼处死小鼠，检查小鼠心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，肉眼观察有无病理改变。

1.5炎症介质测定方法

1.5.1 大鼠炎症组织蛋白含量测定 取“1.4.1”项下组织匀浆离心的上清液0.05 mL，按照蛋白试剂盒说明书测定炎症组织中蛋白含量。

1.5.2 大鼠炎症组织NO含量测定 取“1.4.1”项下组织匀浆离心的上清液0.5 mL，按照一氧化氮试剂盒说明书测定炎症组织中NO含量。

1.5.3 大鼠炎症组织MDA含量测定 取“1.4.1”项下组织匀浆离心的上清液0.1 mL，按照丙二醛试剂盒说明书测定炎症组织中MDA含量。

1.5.4 大鼠炎症组织PGE2含量及血清中COX-1、COX-2含量测定 取“1.4.3”项下血清离心的上清液50 μL，按照大鼠PGE2、COX-1、COX-2酶联免疫检测试剂盒说明书操作方法测定血清中PGE2、COX-1、COX-2含量。

2 结果

2.1紫草三黄栓对足肿胀大鼠炎足组织中PGE2、MDA、NO、蛋白含量和SOD活性的影响与空白组比较，对照组和实验组大鼠炎足组织中PGE2、MDA、NO、蛋白de 含量减少，SOD活力提高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 紫草三黄栓对大鼠炎足组织蛋白、NO、MDA、PGE2含量和SOD活力的影响

注：与空白组比较，★P<0.01。

2.2紫草三黄栓对大鼠气囊炎模型气囊渗出液中白细胞个数的影响与空白组比较，对照组和实验组大鼠气囊渗出液体积减少，渗出液中白细胞个数降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 紫草三黄栓对大鼠气囊炎灌洗液中白细胞数的影响

注：与空白组比较，★P<0.01。

2.3紫草三黄栓对COX-1、COX-2的抑制作用与空白组比较，对照组和实验组大鼠血清中COX-1、COX-2含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 紫草三黄栓对COX-1、COX-2的抑制作用

注：与空白对照组比较☆P<0.05，★P<0.01。

2.4急性毒性实验小鼠外观、行为、分泌物和排泄物均无异常，各组小鼠无死亡。2 w后将小鼠颈椎脱臼处死，进行大体解剖，肉眼观察体内主要脏器，未出现体积、颜色和纹理异常等病变表现。与空白组比较，给药组小鼠体质量无变化，差异无统计学意义(P>0.05)。紫草三黄栓日最大给药量为19.1 g/kg，相当于临床剂量的238倍，见表4。

表4 紫草三黄栓小鼠直肠给药急性毒性实验结果

注：与空白组相对比，★P>0.05。

3 讨论

炎症是具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所发生的以防御反应为主的基本病理过程。机体通过酶或非酶系统产生氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，形成过氧化脂质，并进一步将过氧化脂质分解为丙二醛(MDA)[6]。因此MDA的量通常可以反映机体被脂质过氧化的程度及细胞受自由基攻击的程度。而体内自由基清除剂如超氧化物歧化酶(SOD)可通过清除自由基,抑制脂质过氧化反应。SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力[7]。PGE2作为一种炎症因子,广泛存在于炎症组织中,可与缓激肽、白三烯等炎症介质起协同作用,引起血管扩张和疼痛,加强组胺和缓激肽升高血管通透性的作用[8]。NO是一种重要的信使物质,同时也是一种重要的炎症介质，炎症刺激时可以导致NO的大量产生，继而通过产生氧自由基而引起细胞损伤[9]。另有研究表明，COX-1和COX-2是在PGE2合成起始阶段2种重要的同工酶，对PGE2的合成起着决定性的作用。本研究选择对大鼠外周血中COX-1、COX-2的含量进行测定，旨在探究紫草三黄栓是否具有抑制PGE2合成的初始抗炎作用机制。各剂量组大鼠血清中COX-1和COX-2含量均下降，且与PGE2的含量变化呈正相关性，提示其对抗炎症的作用可能与降低COX-1和COX-2含量，从而抑制 PGE2的合成与释放有关。

角叉菜胶诱发大鼠足跖肿胀和气囊炎是经典且常用的急性炎症模型。本研究显示,与空白对照组比较，紫草三黄栓各剂量可降低角叉菜胶致大鼠炎症模型炎症组织中总蛋白质、PGE2、NO 、MDA含量，增强SOD活性，并可抑制炎症的液体外渗以及白细胞的迁移,渗出液中白细胞数减少，说明紫草三黄栓具有较好的抗炎作用。 提示紫草三黄栓抗炎机制与抑制PGE2、NO、蛋白、MDA等炎症介质生成和增强清除氧自由基、抗脂质过氧化能力以及抑制渗出液中白细胞游走行为有关。

急性毒性实验[10-15]是指动物1次或24 h内多次接受一定剂量的受试物，动物在短期内出现的毒性反应，目的是为新药的研发提供有价值的信息。最大给药量指单次或24 h 内多次(2～3 次)给药所采用的最大给药剂量。最大给药量实验是在合理的给药浓度及合理的给药容量的条件下，以允许的最大剂量给予实验动物，观察动物出现的反应。如果要获取有关药物安全性的信息，则对实验动物的异常反应和病理过程的观察、分析，较以死亡为观察指标更有毒理学意义。为了更好地指导临床用药，对紫草三黄栓进行急性毒性试验，研究结果将为紫草三黄栓的临床合理用药打下基础，并为其临床毒副反应的监测提供参考依据。