Gankyrin基因在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

胡夏韵， 苏天园， 苏丽萍, 蒲红伟

(新疆医科大学1基础医学院， 2公共卫生学院， 乌鲁木齐 830011； 第一附属医院3病理科, 4学科建设科， 乌鲁木齐 830054)

食管癌是常见的上消化道恶性肿瘤，美国2018年消化道恶性肿瘤中，食管癌发病率和死亡率分别为第6位和第4位[1]。我国食管癌发病率和死亡率为第4位[2]。我国食管癌每年平均病死约15万人，男性多于女性，发病年龄多在40岁以上，病理类型以食管鳞状细胞癌(ESCC)为主，其术后5a生存率仅为5%～20%，患者就诊时多已是晚期，是食管癌死亡率居高不下的主要原因，因此寻找新的肿瘤标志物对提高食管癌的诊断、寻找治疗药物靶标和判断患者预后至关重要[3]。癌性锚蛋白重复序列Gankyrin为一种肿瘤相关基因，在肝癌、结直肠癌和乳腺癌等恶性肿瘤中的表达和临床意义均有报道，但在食管鳞癌组织中的表达及意义报道较少，本研究采用免疫组织化学染色法检测食管鳞癌组织中Gankyrin的表达，探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1材料选用新疆医科大学第二附属医院病理科2010年3月-2014年6月期间手术切除的食管癌组织150例，另取同期手术切除的切端未见癌侵及的距离食管鳞癌原发灶5 cm以内的正常癌旁组织50例。标本均经甲醛充分固定，常规石蜡包埋，做4 μm连续切片，进行HE染色和免疫组织化学染色。所有患者术前未经放、化疗治疗，临床资料完整，病理类型均经病理科证实，组织学类型均为食管鳞状细胞癌。该研究通过了新疆医科大学医学伦理委员会批准，选用标本均获得患者知情同意书。

1.2主要试剂浓缩Gankyrin兔抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司，羊抗兔二抗、正常山羊血清封闭液、免疫组织化学SP检测试剂盒、DAB试剂盒、PBS缓冲液、枸橼酸盐缓冲液均购自北京中杉生物技术有限公司。双氧水(H2O2)、甲醇及其余试剂均为国产分析纯。

1.3免疫组织化学检测方法及结果判断采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(S-P法)，浓缩Gankyrin 兔抗人多克隆抗体按照1：100的比例稀释。Gankyrin的表达定位于细胞浆，以胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性染色，按着色强度及阳性食管上皮细胞比例评分，着色强度按无染色计为0分，浅黄色计为1分，黄色计为2分，棕黄色计为3分；按阳性细胞比例，<5%计0分，5%～25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，>75%计4分。两分值相加，≤3分判为阴性(-)，≥4分判为阳性(+)[4],经至少2位有经验的病理科医生盲法观察。

1.4统计学处理应用SPSS13.0 统计软件对数据进行统计,数据结果采用χ2检验和COX多因素分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1食管不同组织中Gankyrin的表达食管鳞癌组织中Gankyrin基因阳性表达率为68.7%(103/150)，食管正常组织中Gankyrin基因阳性表达率为16.0%(8/50)，食管鳞癌组织中Gankyrin基因阳性表达率高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。食管鳞癌组织中Gankyrin基因表达定位于细胞浆，胞质出现棕黄色颗粒，阳性食管上皮细胞比例为70%～90%，食管鳞癌组织中Gankyrin基因表达判定为阳性。正常食管组织中Gankyrin基因表达定位于细胞浆，胞质出现浅黄色或黄色颗粒，阳性食管上皮细胞比例为0%～5%，正常食管组织中Gankyrin基因表达判定为阴性，见图1。

表1 食管鳞状细胞癌组织和食管正常组织中Gankyrin的表达

2.2食管鳞状细胞癌组织中Gankyrin基因表达情况与相关病理参数的关系不同年龄和性别的Gankyrin的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。不同分化程度的食管鳞癌组织Gankyrin的阳性率不同，差异有统计学意义(P<0.05)，并且随着分化程度的变低，食管鳞状细胞癌组织中Gankyrin的阳性表达增加。不同浸润深度的食管鳞癌组织Gankyrin的阳性率不同，随着浸润深度增加，Gankyrin的阳性率表达率也增加，差异有统计学意义(P<0.05)。淋巴结转移情况不同时，Gankyrin的阳性表达率也不同，在有淋巴结转移时，食管鳞状细胞癌组织中Gankyrin的阳性率增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 食管鳞状细胞癌组织中Gankyrin基因表达与相关病理参数的关系

A：食管鳞状细胞癌组织(HE×200)

B： 食管鳞状细胞癌组织(Gankyrin阳性×100)

C: 食管鳞状细胞癌组织(Gankyrin阳性×400)

D: 食管正常组织(HE×200)

E: 食管正常组织(Gankyrin阴性×100)

F: 食管正常组织(Gankyrin阴性×200)

图1Gankyrin基因在食管鳞状细胞癌组织及食管正常组织中的表达

2.3食管鳞状细胞癌组织中Gankyrin基因的表达与生存率的关系150例患者术后3 a总生存率为21.3%(32/150)，其中Gankyrin阳性者的术后3 a生存率为14.6%(15/103)，阴性者为36.1%(17/47)，Gankyrin阳性患者术后3 a生存时间明显短于阴性患者，差异有统计学意义(χ2=8.98，P=0.002)，见图3。

2.4食管鳞状细胞癌预后的COX多因素分析将年龄、性别、分化程度、浸润深度和淋巴结转移情况和Gankyrin基因的表达情况进行COX多因素分析,结果显示分化程度、浸润深度和淋巴结转移情况是影响患者预后的的独立因素,见表3。

图3 Gankyrin基因表达与术后生存率的相关性

进入变量偏回归系数(B)偏回归系数标准误(SE)Wald检验统计量P值Exp(β)分化程度 1.62636.82536.8250.0005.085浸润深度 3.50364.91064.9100.00033.231淋巴结-5.32465.08865.0880.0000.005

3 讨论

Gankyrin也称PSMDl0或p28GANK，是由杂交消减法得到的一种肿瘤相关基因，最早在肝癌中发现表达[4]。研究表明,Gankyrin主要对抑癌基因Rb和p53进行负调控，从而引起恶性肿瘤细胞的增殖、抑制其凋亡[5-6]。同时,Gankyrin也可参与调控与肿瘤相关的炎症信号通路而影响肿瘤的发生和进展[7-9]。

近年来Gankyrin基因作为一种与肿瘤的发生发展关系密切的原癌基因，逐渐成为研究热点。有学者研究发现，Gankyrin介导的肿瘤细胞恶性进展过程与多种信号转导通路及细胞因子有关，能促进肿瘤的增殖和转移[10-15]。这些研究结果表明,肝癌、结直肠癌、胆管癌、乳腺癌、子宫内膜癌等多种肿瘤组织中Gankyrin的表达均参与肿瘤的发生、发展过程，且与肿瘤恶性进展和预后不良密切相关。也有研究显示，Gankyrin基因也与肿瘤的耐药性密切相关，沉默Gankyrin基因可逆转SKOV3/DDP对顺铂的耐药性，可能与抑制药物外排，促进细胞凋亡有关[16]。Gankyrin表达下调能抑制Hep-2细胞的增殖和迁移,与细胞凋亡、细胞周期改变及p53的表达密切相关[17]。

本研究结果表明，食管鳞癌组织中Gankyrin的阳性表达高于食管正常组织，提示Gankyrin在肿瘤发生中起重要作用。Gankyrin基因在食管鳞癌中的表达情况与一些学者在其他消化道肿瘤中的研究结果一致[18-20]。不同年龄和性别间Gankyrin阳性率差异无统计学意义。不同分化程度的食管鳞癌组织Gankyrin的阳性率不同(P<0.05)，随着分化程度的变低，食管鳞状细胞癌组织中Gankyrin的阳性表达增加，提示Gankyrin基因在肿瘤的分化程度判定和预测预后情况中较为敏感。不同浸润深度的食管鳞癌组织Gankyrin的阳性率不同，随着浸润深度增加，Gankyrin的阳性率表达率也增加，差异有统计学意义，提示Gankyrin基因与食管鳞癌的进展关系密切。淋巴结转移情况不同时，Gankyrin的阳性表达率也不同(P<0.05)，在有淋巴结转移时，食管鳞状细胞癌组织中，Gankyrin的阳性率增加，提示Gankyrin基因是与转移关系密切。此外，Gankyrin的阳性表达与患者预后相关，Gankyrin阳性患者术后3 a生存时间显著短于阴性患者，差异有统计学意义，经过COX多因素分析发现，分化程度、浸润深度和淋巴结转移情况是影响患者预后的独立因素。

本研究结果表明，食管癌组织Gankyrin表达水平高于其对应的癌旁正常组织，Gankyrin表达与分化程度、浸润深度及淋巴结转移密切相关，提示其在食管鳞癌发生、发展中起重要的作用。Gankyrin在食管癌方面的研究相关的报道尚少，该基因具体通过什么途径影响食管癌的进展、是否与其他基因存在协同作用等问题还需进一步研究。