长链非编码RNA GHET1在肝癌肝移植组织中表达上调对患者预后的影响

张扬平 柯瑞盛 ，王华翔 ，邓桥 ，蔡秋程 ，杨芳 ，，张坤 ，，江艺 ，，吕立志 ，

（1. 福建医科大学附属闽东医院，福建，宁德 355000； 2.福建医科大学，福州总医院，福建 福州 350025；3.厦门大学附属东方医院，福建 福州 350025；4.中国人民解放军福州总医院，福建 福州 350025）

肝移植（liver transplantation，LT）是目前最主要的原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）治疗手段之一［1］，移植后预防肿瘤复发转移仍是肝癌肝移植研究热点［2］，严重制约了患者的长期生存［3］。肿瘤复发除了与肿瘤的临床特征、术后治疗药物的使用等因素相关外，还与肿瘤本身的生物学行为关系密切，涉及多个基因产物参与［4］。面对供肝来源紧缺的现状，在术前预测复发高危患者以严格掌握手术指征，显得极为迫切［5］， 长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度超过200个核苷酸的内源性细胞 RNA，虽缺乏开放阅读框，但可通过表观遗传，转录以及转录后水平调节蛋白的编码基因，可以在生理过程中发挥核心作用［6-7］。研究证实异常的 lncRNA 表达跟许多疾病相关［8-9］，其在恶性肿瘤侵袭转移中的作用机制已经逐渐被人们所关注。GHET1基因被归类为lncRNA ，lncRNA GHET1在胃癌显著上调，被认为是胃癌特异性lncRNA之一［10］。目前GHET1和肝癌肝移植之间的关系以及GHET1在肝癌肝移植术后复发中的功能作用研究相对较少。本研究旨在检测GHET1在HCC组织中的表达情况，同时分析其表达与肝癌肝移植患者临床病理特征和预后关系，为肿瘤的早期干预和个性化治疗提供新的治疗靶点和防治思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料：收集福建医科大学福州总医院肝胆外科HCC手术患者的HCC组织和配对的2 cm 处正常组织（n＝20），实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测组织中的GHET1表达。回顾性收集2010年1月— 2015年12月106例同种异体原位肝癌肝移植患者的HCC组织和相应临床病理资料，qRT-PCR检测组织中GHET1的RNA表达水平（所有组织均在术中采集后存放于-80℃超低温冰箱）。所有患者术后经病理证实均为原发性肝癌。本研究采取双盲方法，本课题入组前均先征得患者及家属的知情同意，并于福州总医院伦理委员会处备案并批准实施。入组标准： ① 具有乙肝病毒感染背景；② 术前未行任何抗肝肿瘤相关治疗。排除标准： 术后3 个月内因严重并发症而死亡者。手术方法：采用原位经典肝移植加经下腔静脉逆灌注。106例患者的供体来源为司法途径供肝（81例，76.42%）和公民死亡器官捐献供肝（25例，23.58%）。抗乙肝病毒复发方案为：恩替卡韦和乙型肝炎人免疫球蛋白联用。术后免疫抑制剂使用：术后免疫抑制方案常规采用激素+他可莫司+吗替麦考酚酯。106例肝癌肝移植患者的临床参数见表1。

表 1 GHET1 的阳性表达与肝癌肝移植临床参数的相关性

1.2 随访：随访截止至2017年12月，主要通过电话和门诊复查等方式对患者进行随访，详细记录患者术后的无瘤生存时间、肿瘤复发时间、肿瘤复发部位、患者死亡时间等（均以月为单位），将1 年内未到门诊随访或电话无回音者视为失访。

1.3 主要试剂：Trizol试剂、real-time PCR SYBR Green试剂盒、逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。内参GAPDH、目的基因lncRNA GHETl均由上海英骏（Invitrogen）公司设计合成，引物序列如下：GAPDH F：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'和R：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'；GHET1 F：5'-GAACAAAGCAGGTAAACATTGG-3'和 R：5'-GCAAAGGCAGAGTGAAAGGT-3'。

1.4 RNA提取和qRT-PCR检测：按Trizol试剂说明书提取组织中的RNA，应用TaKaRa逆转录试剂盒合成cDNA的第一链，按照SYBR Green试剂盒说明书操作，基因定量经LightCycler 480 PCR仪测定，每个样本3个复孔，重复3次，最终数据以2-△△Ct进行分析。

1.5 统计分析：采用SPSS23.0软件和GraphPad Prism5.0软件处理，通过t检验进行数据分析。所有数据以均数±标准差（±s）表示。GHET1表达水平与其他因素的相关性采用卡方检验或独立t检验。采用Kaplan-Meier方法计算患者生存期，根据术后随访结果计算患者总生存期。组间生存期比较则采用秩和检验，检验水准α＝ 0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝癌肝移植患者随访结果：所有患者均获得随访。本组患者平均年龄为（49.60±11.40）岁，肿瘤平均直径6.0 cm（4.0～17.0 cm）。截止至2017年12月，106例肝癌肝移植患者随访时间3～96个月，中位随访时间35个月，5年总累积生存率为18.87 %（20例），随访期间共有50例（复发率46.17 %）肿瘤复发，复发时间为术后2～55个月，中位时间14个月。复发转移部位依次是肺26例（52.00 %）、肝22例（44.00 %）、骨8例（16.00 %）、脑6例（12.00 %）、腹腔1例（2.00 %）、腹膜3例（6.00 %）、胸膜2例（4.00 %）、膈2例（4.00 %）、纵隔1例 （2.00 %）、肾上腺1例 （2.00 %）、胰1例（2.00 %）。

2.2 肝癌肝移植组织中GHET1表达检测及与肝癌复发的关系：qRT-PCR检测20对肝癌及相对应癌旁组织中mRNA的表达水平。结果显示，GHET1在HCC组织中明显高于配对的邻近非肿瘤组织（图1A），提示在肝癌组织中GHET1表达水平增高（P＜0.001）。将106例肝癌肝移植患者分成肝癌复发组（n＝50）和肝癌未复发组（n＝56），与肝癌未复发组相比，复发组GHET1表达明显升高（P＜0.001），见图1B，差异具有统计学意义，结果表明GHET1表达与术后肝癌复发具有相关性。

图1 a：HCC组织和邻近非肿瘤组织GHET1表达检测；b：实时定量PCR检测106例肝癌肝移植组织中 GHET1表达及与肝癌复发关系，aP＜0.001， n＝20

2.3 GHET1表达与HCC患者临床病理学特征关系：本研究结果表明GHET1表达与肿瘤包膜（P ＜0.001）、肿瘤直径（P＜0.01）、分化程度（P＜0.01）、血管侵犯（P＜0.01）和TNM分期（P＜0.01）密切相关，而与患者的年龄、性别、肝硬化、AFP水平、血清NLR值、肿瘤位置和肿瘤数量无关（P＞0.05），见表1。

2.4 GHET1表达与肝癌肝移植患者疾病预后：根据106例患者肝癌肝移植组织标本GHET1表达检测的中位值（中位值＝4.939），将其分为低表达组（53例）和高表达组（53例），对患者的生存预后进行统计分析。结果提示GHET1高表达组累积复发率显著高于低表达组（P＜0.05），GHET1高表达组累积生存率显著低于低表达组（P＜0.001），提示在肝癌肝移植术后发生发展的过程中GHET1起着一定的作用，可用于判断患者的预后（图2）。两组肝癌肝移植患者1、3、5年累积复发及生存情况见表2。

图 2 GHET1不同表达与肝癌肝移植患者累计术后复发转移率和累计术后生存率的关系

3 讨 论

对于肝癌肝移植患者而言，预防肝移植术后肝癌复发仍然是患者术后能否长期生存率的关键问题。因此，在肝癌肝移植术前能预测复发高危患者并以严格掌握手术指征，显得极为重要［5，12］。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）作为一种生化标志，在肝癌的鉴别、早期诊断及治疗中扮演着重要角色［13］。但约30%肝癌患者的AFP为阴性，而且这类患者近年来更加常见［14］，发现其他敏感肿瘤生化标志，并进一步研究其分子机制，对于AFP阴性肝癌患者尤其具有重要意义［14］。因此，需要综合的方法来确定和验证新的肿瘤标志物，并找到更有效的治疗策略来改善HCC诊断、预后及治疗。

表2 两组肝癌肝移植患者 1、3、5年累积复发和累积生存情况比较

LncRNA能够调节不同层次基因表达，包括染色质、转录、转录后修饰和翻译［15］。研究结果表明，许多lncRNA在HCC中有差异表达，这些lncRNA的失调与HCC进展相关，可能作为HCC诊断和预后的潜在生物标志物。lncRNA可能通过结合启动子区域和/或改变组蛋白标记和染色质状态来调节基因转录［16］。另外，它们可能与蛋白质的相互作用和改变相关，对癌症生物学具有重要作用［17］。之前的研究中发现位于染色质第7基因间区域的GHET1通过上述机制发挥其作用［10］。

目前，已知 GHET1与结直肠癌［18］、胃癌［10］及膀胱癌［19］的发生相关，并作为与肿瘤增殖和侵袭密切相关的癌基因，与肿瘤预后相关。在一项研究中，证实GHET1在HCC组织和细胞系中的上调部分是由其启动子的H3K27Ac乙酰化水平的增加所介导的，GHET1并可通过ATF1调节HCC细胞的增殖和侵袭［20］。另一项研究认为GHET1是一种生长调节因子，敲低GHET1可抑制HCC的细胞增殖，并且还引起细胞周期停滞诱导HCC细胞凋亡，GHET1可以通过募集PRC2到KLF2启动子区域，调节Kruppel样因子2 （KLF2） 在HCC细胞中的转录［21］。

在本研究中，我们检测了GHET1在肝癌组织和周围正常肝组织中的表达。我们的研究结果表明，与邻近的正常肝组织相比，GHET1在肝癌组织中上调，并且GHET1上调与肿瘤包膜、肿瘤直径、分化程度、血管侵犯和TNM分期密切相关，而与患者的年龄、性别、肝硬化、血清AFP水平、血清NLR值、实体瘤位置和实体瘤数量无关。同时比较两组实时定量PCR检测GHET1表达量及与肝癌复发关系，结果表明GHET1表达与有无肝癌复发具有相关性，差异具有统计学意义。本研究结果同时也提示GHET1过表达肝癌肝移植患者累积复发率显著高于低表达患者（P＜0.05），GHET1过表达肝癌肝移植患者累积生存率显著低于低表达患者（P＜0.001），提示肝癌组织中GHET1异常高表达者可能具有复发和转移的潜在风险，说明GHET1可能在肝癌发生发展及肝移植术后复发均具有一定的作用，可能作为肝癌肝移植患者中诊断和预后的候选生物标志物。

然而，由于本研究为单中心回顾性研究，上述结论仍需大样本和多中心临床研究进一步证实。但本研究仍证明GHET1在肝癌中的表达上调，与肝移植术后肝癌的复发转移有关。目前GHET1在肝癌肝移植复发中的调控尚未明确，有待进一步研究。

利益冲突：所有作者声明没有利益冲突。