同种异体排斥反应的研究进展和实验室检测的临床观点

刘伟（译），Qiang Shi（石强），Afzal Nikaein（著） （.天津市第一中心医院，天津009；.威斯康星大学，麦迪逊分校，医学与公共卫生学院外科学系移植科，美国 威斯康星州 麦迪逊 900； .医疗城达拉斯医院移植免疫中心，美国 德克萨斯州 达拉斯 750）

全球器官移植的需求一直在稳步增长，新的挑战可能会在未来几年内大大改变医疗领域。根据美国器官共享网络（United Network for Organ Sharing，UNOS）的数据，2016年美国进行了超过33 600例器官移植手术。由于医疗保健、营养和公共卫生的改善，将延长全球人类的预期寿命，对器官移植的需求一直在稳步增加。

为了进一步实现器官移植的可行性，除了降低成本和增加可移植器官的可用性外，更重要的是减少移植排斥反应及改善移植物的功能。最近，分子诊断学、蛋白质组学和合成生物学等新的检测方法逐渐应用于受体移植状态的评估，并且越来越多与移植物排斥反应相关的新基因、微小RNA、蛋白质和反应途径被陆续发现［1］。随着这些发现的不断加快，评估这些分子标记物在临床诊断中的意义则变得更为重要。除了评估这些指标对同种异体移植早期排斥反应的检测灵敏度和特异性外，还必须了解这些指标所表示的临床信息，最终成功地将我们的科研成果转化为临床决策指标。

在这篇综述中，我们将讨论导致同种异体移植排斥反应的先天和适应性分子和细胞免疫反应。另外，我们将重点关注移植时发生的排斥反应，以及仅在活检样本中发现的亚临床排斥反应。然后从实际角度介绍新型预测器官移植排斥反应发生风险的检测技术。最后提出有助于实验室诊断移植物排斥反应的新方法。最终目标是提供见解，帮助研究人员在实体器官移植后对排斥反应发生进行早期诊断成为可靠、无创的工具，并帮助临床医生根据生物标记物开发个性化的移植前和移植后治疗。

1 同种异体反应细胞及其作用方式

值得一提的是，同种异体移植物的免疫损伤涉及先天免疫系统和适应性免疫系统之间复杂的相互作用［2］。图1列出了与同种异体排斥反应有关的成分以及先天和适应性免疫系统的主要特征。通常，在器官移植手术期间发生的组织损伤触发先天免疫系统，包括由吞噬细胞和树突细胞提呈的同种异体抗原。先天免疫系统的激活启动并放大了初始T细胞和B细胞分化，而B细胞需要T细胞的帮助以产生抗体。即使免疫系统的某一个组成部分可能占主导地位并导致排斥反应，但排斥反应通常是由多种机制、多因素整合产生。正如Thomas等［3］的研究表明，移植器官的失败是由微血管中人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）抗体介导的炎症反应造成，这一结果是先天性和适应性免疫反应所产生的细胞因子造成的。

1.1 对供体器官的初始先天免疫反应：危险相关的分子模式（danger-associated molecular pattern，DAMP）能够促进同种异体移植物的即时免疫反应。在受体与供体器官接触的0～12小时内，危险相关分子立即起作用。DAMP与模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）结合，而这些模式受体的成员、分子结构和功能均与移植物排斥反应相关［4-5］。PRR主要表达于抗原递呈细胞，包括吞噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）、肥大细胞、内皮细胞和器官实质细胞。当供体器官移植到受体中时，来自供体器官的抗原递呈细胞可以通过血液循环感知从受损或应激组织释放的宿主衍生分子，并通过激活PRR，导致早期排斥反应的发生。因此，整个身体能够感知从受损移植组织释放的保守肽序列并鉴别出这些肽段来自入侵的非自身抗原。尽管PRR的研究起源于感染的患者中，但最近的研究数据表明这些受体参与了器官排斥反应［6-7］。

一旦识别出同种异体移植抗原，PRR就会触发一系列信号导致细胞质核转录因子（NF-κB）蛋白复合物转运到细胞核中。这种信号转导的结果是导致炎症相关的基因转录迅速增加，通过活化的内皮细胞和实质细胞稳定持续产生促炎细胞因子、趋化因子和黏附分子。这种早期炎症反应通过上调共刺激分子表达来加速排斥反应，这破坏了共刺激和共抑制信号之间的平衡，导致更大的组织受损。因此，移植后不久就会发生抗原非依赖性促炎症反应，它参与早期同种异体移植排斥反应［8-9］。尽管有许多实验方法可以检测PRR，但很少有实验室的检测数据能够让临床医生评估PRR相关的先天免疫状态。因此，这是临床实验室评估同种异体移植物先天性反应的未解决的问题之一，先天性免疫监测将越来越受到重视。

1.2 移植过程中激活的同种异体免疫细胞的鉴定：适应性免疫是对移植物先天免疫应答的延续，它特异地靶向同种异体移植物。同种异体移植物反应性（同种异体反应性）免疫细胞在适应性免疫反应中起主要作用，这在很大程度上决定了移植物是否被接受、被排斥或耐受（图1）。基础和临床研究人员正在研发实时跟踪这些细胞的方法，以监测同种异体反应，这将使临床医生能够对移植结果进行早期预测［10］。有多种技术可用于鉴定和定量供体特异性T细胞、B细胞和浆细胞，这些方法的简要概述如下：

用于测量适应性免疫应答的最古老和最广泛使用的体外试验是1963年建立的混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR）。来自供体的外周血单核细胞与来自受体的外周血单核细胞共培养，并监测同种异体反应性T细胞的活化和增殖以及产生细胞因子的情况［11］。这种临床相关的功能测定经过广泛优化和标准化，重复性符合临床监测标准。根据MLR监测的读数，我们还可以通过修改MLR的实验方法，并通过MLR的检测读数得出同种异体移植物排斥反应的各种指标。例如，溴脱氧尿苷可用于指示增殖细胞，并且可通过使用有限稀释法依次测定经过不同浓度稀释的应答细胞来检测针对供体细胞的细胞毒性。与流式细胞术或酶联免疫斑点试验（ELISpot）结合使用，MLR使我们能够精确量化刺激后产生细胞因子的细胞数量，并确定参与共刺激、抗原递呈、细胞因子产生和趋化性等各种免疫活动的细胞表面分子表达。细胞周期标志物Ki67或细胞内羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，其强度在每次细胞分裂时减半，通过对其定量测量细胞增殖情况，而MLR主要测量的是T细胞增殖情况。来自人外周血的初始和记忆CD4+和CD8+T细胞均证明可用此方法检测细胞增殖。根据实验方法和样品类型不同［12-13］，1%～10%的T细胞群体具有同种异体反应性。

图1 涉及同种异体排斥的分子和细胞成分

需要注意的是，MLR结果表明存在同种异体识别的直接途径，其中T细胞被同种异体抗原递呈细胞激活。MLR数据与体内情况存在差别，其中一个重要差别是：体内T细胞是被源自自体细胞呈递的供体蛋白分子肽激活。这种差异在免疫识别方面是至关重要的，因为当它们由自体细胞呈递时，整个主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）分子在受到异体细胞和自体细胞递呈的抗原肽激活时，功能是完全不同的，另外它们产生不同克隆的能力也有所不同。目前MLR主要用于制药行业，尚未用于临床评估。

为了给临床提供细胞排斥反应的证据，需要检测出能够识别供体MHC的T细胞的确切数量和含有的不同的T细胞克隆。鉴定同种异体反应性克隆的方法包括新一代测序以及荧光激活细胞分选［14-15］。在离体培养中，将受体T细胞与供体细胞反应，并使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯标记对分裂细胞进行分选。从该分裂群体以及未处理的受体T细胞中提取基因组DNA，并对T细胞β链CDR3区域进行高通量测序。将数据组合以产生特异于T细胞的“指纹”，用于受体对供体细胞的反应。利用这种技术，可以在移植后的外周循环中鉴定出由于同种异体反应而产生的数千个克隆。几个小组正通过使用这种方法研究它们的临床相关反应。

MHC分子的区段可以形成肽MHC多聚体，当用荧光团标记时，这些寡聚体可以特异性结合靶MHC，使多克隆同种异体反应细胞能够追踪到单一供体抗原。由于其具有高特异性和可重复性，肽MHC多聚体已成为测量小鼠中抗原特异性T细胞应答的最广泛的工具之一。

在此技术用于人类之前，仍有一些难题需要解决。肽MHC多聚体的设计需要选择同种异体反应细胞可识别的肽，而个别人群可能表达与研究用HLA等位基因不同的亚型，这一缺陷暂时限制了该方法的使用。使用肽多聚体进行功能研究的另一个缺点是肽与细胞上受体结合的动力学。这种结合可能改变T细胞增殖并表现出效应功能。例如，T细胞在体内结合天然加工的抗原的平均时间为7秒，但结合合成肽的平均时间长达967秒。这种结合时间的延长是否影响下游信号转导的方式尚未明确。科学家现已使用可逆形式的肽MHC，但如何应用还有待进一步的研究。

对于某些类型的淋巴细胞，细胞培养条件尚未完全优化，因此，体内刺激同种异体细胞的研究是鉴定同种异体反应性T细胞的另一种方法。跨体迟发型超敏反应模型是目前使用的检测方法，其使用患者样本研究同种异体排斥反应［16-17］。研究人员从受体中分离外周单核细胞并制备裂解的供体细胞。然后，他们将这些细胞的混合物注入严重联合免疫缺陷小鼠的足跖中。24小时后，注射同种异体反应单核细胞的小鼠比单独注射自身单核细胞的对照小鼠产生更大的肿胀和过敏反应。该反应表明患者通过间接途径对供体抗原产生免疫记忆，因为裂解物缺乏完整的供体抗原递呈细胞。尽管体内试验比体外和离体模型更具优势，这些刺激是在几个月到几年内从移植组织中获取和加工的，通过这些方法进行的刺激可能无法反映器官移植过程中供体抗原的真实情况。

基于肽MHC四聚体的检测体系已用于检测移植致敏后抗原特异性B细胞的扩增和分化。在通过同种异体反应抗原进行初始刺激后，B细胞经历了亚型转换过程，被激活并离体分化成抗体分泌细胞。IgG的亚型转换可以通过IgG ELISpot方法或细胞上清中的IgG类别测定完成。最近，一些研究组使用包被有HLA分子的微球结合HLA特异性B细胞，形成HLA珠-B细胞结合物，并可通过流式细胞术鉴定。通过这种方法，可以快速确定HLA等位基因特异性B细胞的特性、频率以及它们的表型，检测时间与供体特异性抗体的常规检测相同［18］。

B细胞的原代培养物（抗体产生者）比T细胞培养物更难进行培养，而且暂时还未建立体外B细胞检测体系。克服原代B细胞培养困难的一种解决方案是使用饲养细胞与B细胞接触，促进B细胞增殖和分化。这种方法可以将记忆B细胞分化为长寿浆细胞，它们产生的同种异体抗体是产生抗体介导排斥反应的关键［16］。浆细胞是另一种难以追踪的细胞类型，因为它们不表达特异的标记物，几乎不表达CD19或B细胞受体。虽然浆细胞表达CD138，但由于其他细胞也会表达CD138，因此缺乏特异性。最近使用固定抗IgG和生物素化MHC单体的ELISpot试验来检测分泌MHC特异性抗体的浆细胞。研究人员利用这种方法对浆细胞进行检测发现，移植后浆细胞在脾脏的数量增加了104倍，在骨髓增加了103倍。这些组织驻留的长寿浆细胞被认为是血清学记忆的原因，并且是供体特异性抗体产生的主要来源。一旦鉴定出浆细胞，立即制定脱敏方案，该方案可以消除患者体内产生排斥反应抗体的细胞［16-18］。

2 同种异体抗体：特征和临床相关性

在过去10年中，制药工业已经生产出有效的免疫抑制药物，可以预防或治疗T细胞介导的排斥反应［19-20］。因此，已经很好地控制了移植患者移植后数天或数月内急性细胞免疫排斥反应的发生。但大多数同种异体移植物的丢失是由于移植后几个月开始发生的抗体介导的排斥反应（antibody mediated rejection，AMR）造成的。大多数实验室依靠如Luminex平台的免疫测定，对患者的HLA抗体进行检测。在临床实践中，群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）在移植前和移植后均为常规检测项目。计算的PRA（cPRA）是基于当地人群的PRA频率的校正比率，用于指示当地供体组织库中，供体患者产生急性排斥反应的可能性。此外，移植前PRA正在成为虚拟交叉配型的一部分。

2.1 AMR及其特征：AMR是一种通过多种机制发生的动态过程。一般认为急性排斥反应依赖于补体系统，而慢性排斥反应不依赖补体［21-22］。图2显示了AMR的基础机制，主要由新生供体特异性抗体参与的AMR导致移植物失功。在最初的同种异体反应中，HLA和非HLA抗原激活T细胞并将加工的抗原递呈给最终产生抗体的B细胞，最终通过B细胞产生单克隆抗体。这些抗体在特异性、对补体蛋白的亲和力、同亚型/亚类、平均荧光强度、密度和糖基化均具有差别［11，23］。当新生供体特异性HLA抗体或非HLA抗体（如IgG1和IgG3）能够固定补体蛋白时，它们倾向于激活补体复合物，并将补体通路的C3d或C4d片段沉积在微血管周围。补体固定抗体在C1q结合试验中也具有阳性反应。然而，某些抗体的亚型，如IgG2和IgG4，缺乏补体固定能力，并不会在微血管上引起补体沉积［24-25］。在急性排斥反应中，供体特异性抗体通过结合补体激活Fc受体，从而引起移植物损伤。在供体特异性抗体新生或长期存在时，这些抗体会作用于内皮表面，并通过偶联和聚集同种异体HLA分子激活信号通路［26-27］。

图2 抗体介导的排斥反应和预后的机制

交叉配型是一种成熟的实验室方法，用于在微量滴定板上检测与补体结合抗体裂解淋巴细胞的能力。然而，目前没有类似的方法检测微血管床中发生慢性排斥反应的早期迹象。图3显示了移植物的病理学结果以及可在实验室中监测的移植物失功指标。这些指标包括供体特异性抗体、C4d表达和移植物活检组织异常，包括微血管炎症及其慢性后遗症、移植肾小球病和基底膜多层化。移植物功能延迟恢复的根源在于微血管炎症，这会显著影响患者的整体预后［28-30］。目前用于病理评估的方法是活组织检查，但它昂贵且不切实际。但目前的血液检测排斥反应，如PRA可能会产生模棱两可的结果。因此，必须开发一种能够准确和特异性的诊断移植患者排斥反应发生风险的检测手段。

图3 移植物排斥的病理生理学和临床诊断和预后的可检测改变

2.2 抗体库和移植结果之间的差异：尽管PRA是AMR中使用最广泛的预测试验，但PRA所代表的致敏程度可变且不一致。受者的抗体状态与受体移植环境不一定完全一致［31-32］，但其不可以用于精确选择相容性供体或比较选择不同供体时，患者的相对预致敏程度［33］。研究发现，这些抗体同生不同命［34-35］，而且它们的功能或临床意义差异非常大。在分子水平上，致病性抗体与抗原表位结合，以此激活细胞信号传导途径并导致一系列生物反应。有害的同种异体抗体如果被补体激活，通过白细胞黏附、内皮细胞激活和微血管增殖等反应促进病理改变，最终导致移植物损伤。如果一些抗体仅与非活化抗原表位结合，则它们可能不会损伤移植物。如今，越来越多的文章报道表位生物学研究以及抗体和抗原表位的相互作用如何影响实体器官移植［19，36-38］。随着对同种异体抗体与HLA抗原表位结合的了解加深，有望揭示出临床AMR的解决方案。

为了弥合抗体性质和临床结果之间的差异，我们简要回顾B细胞是如何产生抗体的。Kosmoliaptsis等［39］的研究详细介绍了HLA分子的高分辨率分型、三维结构与其同种抗体结合特征之间的关系。初始B细胞识别的任何特定三维结构均可以引发单克隆B细胞系发育，产生针对该区域的特异性抗体。这些区域统称为“表位”。由于HLA抗原分子巨大，受体的免疫细胞仅识别HLA分子的某个表位而不是与整个HLA分子反应［40］。实际上没有任何抗体可以识别整个HLA分子，抗体识别的仅特定的抗原表位。换言之，供受体一个HLA分子错配，可能产生多个针对不同错配表位的单克隆抗体。事实上，这些抗体谱决定了受体对同种异体移植物的耐受能力。迄今为止，已经开发了几种算法用来分析肽 - 表位的结合能力，以此预测AMR的发生风险。科学家在不久的将来就可以确定每个HLA分子上的所有表位，这将是获得确切B细胞克隆特征的重大进步［41］。

2.3 固相珠测定的缺点：20世纪90年代，基于Luminex的固相检测技术通过引入荧光标记微球成为最广泛使用的HLA抗体检测方法。该方法将一种或多种体外合成的人类HLA抗原固定在微球上。如果患者的血清含有HLA抗体，它将与相应的微球结合，并通过Luminex检测得出结果。微球不仅可以指示血清中存在的抗体的类型，而且还基于微球表面上抗体饱和度不同显示的平均荧光强度的变化提示抗体数量。血液中循环的抗体越多，微球表面上抗原 - 抗体结合的饱和度则越高［42］。

该方法非常灵敏并具有特异性，但在临床使用多年后逐渐发现大量患有慢性AMR的患者在诊断时没有检测到循环HLA抗体。最近的几篇综述文章描述了实验室检测报告与临床结果之间存在相当大差异的理论和现实原因。Filipone等［41］的研究显示，固相珠测定仅检测可以与制造商设计的固定化表位结合的同种异体反应性抗体。如果反应性抗体的结合区域不适用于微球上靶HLA的表位，则将产生阴性结果［42-43］。之前发现不良免疫反应之前，均不能获得各种抗体等位基因的信息。生产用于同种异体抗体检测微球的制造商依赖的是抗原表位而不是整个HLA分子结构的合成肽。不幸的是，很少有临床系统研究结果可以评估这种技术对临床结果的影响程度。此外，抗体与微球上抗原的结合没有功能意义，因此这些测定的结果不能使我们断定检测到的抗体是否具有病理学后果。该测试只能表明患者的致敏状态，但不能用于预测实际临床结果。试剂盒也缺乏相关方面的单独测试，实验室很难对灵敏度、荧光阈值设定、非天然HLA影响等制订同一标准。这些问题均与该试剂盒的设计相关，以上问题仍有待解决，希望最终可达到直接检测致病性同种异体反应性抗体的水平。

由于上述原因，急需研发能区分致病性抗体和非致病性抗体的试剂盒。正如我们前面提到的，致病性抗体不仅通过结合抗原上的相应表位而发挥其作用，而且还可以引发随后的生物反应。它们可以通过Fc介导或Fab介导的两种不同途径引起排斥反应（图2）。约20%肾功能稳定且经过活检认定没有排斥反应症状的患者对供体特异性抗体呈阳性反应。一半以上的预存供体特异性抗体患者没有发生排斥反应，且在活检时未发现亚临床AMR症状。然而，在含有低滴度供体特异性抗体的患者中却可能发生排斥反应，这表明供体特异性抗体水平与排斥反应的发生率不完全相关。使用功能性抗体测试可以解决这些问题。这些检测方法的开发将为通过Luminex系统评估器官排斥反应的发生提供补充数据。

2.4 用于检测AMR的新检测方法：为了满足功能检测的需要，我们正在开发一种新型的细测定方法。我们设计了一个由人体细胞制成的模拟细胞系统，在体内反映受体体液因子与移植血管之间错综复杂的相互作用。实验室研究表明，将群体反应性抗体与内皮细胞一起孵育后，会导致内皮细胞被激活并发生功能障碍［38，44-45］。进一步的研究表明，HLA抗体和非HLA抗体可以充当刺激剂引发细胞内信号传导。移植组织的炎症反应和细胞增殖是同种异体器官存活的最重要决定因素［11，19］。我们正在努力将实验室研究结果转化为能够定量检测的技术。我们对检测方法的研发基于活化的内皮细胞释放促炎细胞因子并在表面上表达高水平的黏附分子。这巨噬细胞和淋巴细胞浸润的分子基础，病理上定义为血管炎或微血管炎症，是早期异体排斥反应的代表。

供体特异性抗体的功能检测影响器官移植的临床决策。目前，活组织检查是诊断AMR的唯一方法，暂时没有其他检测方法可以确诊AMR。 AMR的当前诊断依赖于基于细胞和/或结构改变的Banff分类，然而，这些分类被认为是“假定的”，而不是决定性的。此外，没有明确的方法来诊断亚临床AMR［33，46］。我们提出的检测方法可能潜在地反映了受体体液免疫应答与移植血管床之间相互作用的状态，并以更高的准确性和精确度掌握移植物的健康状况。该方法不仅可以检测内皮细胞活化的发生，还可以量化受体血清和供体细胞之间相互作用的程度，这可能是器官排斥反应的最早迹象［21-22］。因此，该检测的研究成果可为临床医生在不经过活检的情况下监测移植物的健康情况和检测移植排斥反应的发生提供帮助。