CRISPR基因编辑技术研究进展及其在水生生物中的应用

马杭柯，孙金秋，徐莞媛，阎斌伦，2，3，4，高 焕，2，3，4

（1．江苏省海洋生物技术重点实验室，淮海工学院海洋生命与水产学院，连云港 222005；2．江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，连云港 222001；3．江苏省海洋资源开发研究院（连云港），连云港 222005；4．江苏省农业种质资源保护与利用平台，南京 210014）

基因编辑技术是在DNA水平，通过删除、插入等方式对DNA特定序列进行改造的技术。在CRISPR／Cas9技术出现以前，人们主要通过锌指核酸酶技术（Zinc-finger nuclease，ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶技术（transcription activator-like effector，TALENs）来实现编辑基因的功能。锌指核酸酶和类转录激活因子效应物核酸酶都是由特异DNA结合蛋白与DNA核酸内切酶FokⅠ的切割结构域组成。这些核酸酶可以在特定位点对 DNA进行切割，形成双链断裂（double strand break，DSB），随后在非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）或者同源重组（homologous recombination，HR）修复机制下实现基因编辑［1］。ZFN和TALEN技术提高了打靶效率，降低了安全风险，实现了对基因组的定点编辑。然而，对ZFN和TALEN的结构域进行改造需要花费大量人力物力，成本昂贵，使其应用受到很大限制［2］。CRISPR／Cas9的出现很好地解决了上述方法存在的问题，为基因编辑提供了一把精确的手术刀，可以对目的序列进行更简便、廉价的编辑［3］。

目前，CRISPR基因编辑技术已经运用于各类陆生生物，包括对拟南芥（Arabidopsis thaliana）多种细胞进行突变［4］、利用小鼠（Musmusculus）进行癌症建模［5］、选育水稻（Oryza sativa）新型品种［6］、改造猪（Sus scrofa）多能干细胞［7］、治疗人类（Homo sapiens）基因疾病［8］等，同时，水生生物中该技术也开始得到应用，如在斑马鱼（Danio rerio）［9］、七鳃鳗（Lampetra japonica）［10］等物种中均已成功实现基因编辑。本文就CRISPR基因编辑技术目前的研究进展及其在水生生物中的相关应用展开综述，以期为科研工作者们在水生生物研究中进一步应用该技术提供帮助。

1 CRISPR／Cas

1．1 CRISPR／Cas系统的发展历程

CRISPR存在于40%的细菌和90%的古细菌中，是细菌抵御外界入侵的获得性免疫系统，可以识别、整合并切除外源 DNA［11－13］。早在 1987年，ISHINO等［14］在对大肠杆菌基因组进行研究时，发现其碱性磷酸酶附近存在串联间隔重复序列。2002年，JANSEN等［15］正式将此种结构定义为 CRISPR。2006年，有 研 究 人 员［16］预 测CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式行使其免疫功能。根据此预测，BARRANGOU等［11］于2007年首次发现并证明细菌可能利用CRISPR系统抵抗噬菌体入侵。随后，MARRAFFNI等［17］发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移。直至2012年，JINEK等［18］利用II型的CRISPR／Cas9系统实现了DNA特异性位点的双链断裂，是CRISPR／Cas9系统应用于基因组定点编辑的开端。由此之后，CRISPR技术开始广泛应用于各种物种甚至在人体内也进行了基因编辑实验［19］。

1．2 CRISPR／Cas系统的分类与结构

CRISPR／Cas系统根据Cas蛋白的差异可以分为3类［20］：第一类是多个蛋白同crRNA结合成复合物，在 PAM（protospacer adjacentmotifis）元件的辅助下，使Cas3蛋白可以精确区分需要降解的外源DNA与序列完全相同的自身DNA，从而实现对外源DNA的识别与切除；第二类则是在PAM元件的辅助下，由Cas9蛋白参与crRNA成熟以及对外源DNA的识别与剪切；第三类不需要PAM参与，主要由Cas10蛋白参与crRNA成熟以及对外源DNA的识别与剪切。其中第二类CRISPR／Cas9系统仅存在于细菌中，但相比于其它类型的复杂蛋白质复合体，其只需要Cas9蛋白参与，结构与操作更加简洁，是目前主要运用的类型。

以第二类型为例（图1），其CRISPR／Cas9系统主要包括 5′端 tracrRNA（trans-activating crRNA），一系列Cas蛋白编码基因，以及3′端的CRISPR基因。其中5′端tracrRNA可以与crRNA形成复合物，帮助 Cas9蛋白识别并切割外源DNA。3′端的CRISPR基因位点其序列由一个前导区（Leader）、多个短而高度保守的重复序列区（Repeat）和多个间隔区（Spacer）组成［21］。前导区一般处于CRISPR位点上游，通常由300～500 bp碱基组成，富含AT碱基。此区域在同种内高度保守，但是种间差别较大。余下部分则由多段25～50 bp长度的高度保守的重复序列和26～72 bp长度的间隔片段互相串联而成［22］。在一个CRISPR位点中，重复序列是高度保守的，5′端和3′端 部 分 尤 为 保 守，分 别 为 GTTT／g和GAAAC［23］，而间隔区却几乎没有相似的序列存在，可能因为它是对不同病毒DNA整合后留下的残余，作用是获得对不同病毒的免疫记忆能力。

1．3 CRISPR／Cas系统的作用机制

同样以第二类型CRISPR／Cas9系统为例（图1），其作用主要分为3个阶段，分别是新的间隔序列的获得、crRNA的成熟以及Cas9蛋白对外源DNA的切割。第一阶段也可以理解为适应，即噬菌体或质粒第一次侵染时，其一小段DNA序列会被Cas1和Cas2蛋白整合到CRISPR位点的前导区和第一个重复序列之间，并重新复制一个重复序列，形成新的重复-间隔单元，从而保存了外源DNA的序列信息，为适应性免疫奠定了基础。当同类噬菌体再次进入有适应性的细菌时，重复序列会截取和保留入侵噬菌体的某些DNA形成间隔序列，随后转录成前体crRNA，经Cas蛋白切割成成熟crRNA（包含一个间隔序列和部分重复序列）后与 tracrRNA形成双链二级结构［24－25］并吸引Cas9蛋白形成复合体，随后在PAM序列的帮助下，即可使靶DNA序列中PAM下游3 bp处的双链均断裂。

因此，由以上机制引导，只需要人工合成特异性crRNA并将其成功转入合适的质粒中，与表达tracrRNA和Cas9蛋白的质粒共侵染细胞，就可以得到特异性基因敲除的细胞系或者动物模型。为了操作更加简便，JINEK等［18］以一段更加简单的单链引导 RNA（sgRNA）替代 crRNA和tracrRNA组成的双链RNA复合体，发现其同样可以与Cas9蛋白结合并切割DNA双链。因此，也可以直接将sgRNA同Cas9RNA混合后以显微注射法导入受体受精卵，大大简化了繁琐的操作。

2 CRISPR／Cpf1

CRISPR／Cas技术的发现，无疑把基因编辑领域的研究带上了高峰，然而CRISPR／Cas技术也存在着脱靶效应等许多问题，使其至今难以应用于人类基因编辑。研究者继续对CRISPR家族进行深度挖掘，进一步发现了具有更高基因编辑效率的Cpf1蛋白［27］。CRISPR／Cpf1系统根据其结构和功能被定义为Ⅱ类Ⅴ型CRISPR系统。其Cpf1蛋白为三角型单体，未与crRNA结合时处于较为松散的状态，一旦与crRNA结合便显著改变其构象，从而具有切割目的序列的能力［28］。人们发现Cpf1蛋白在某些菌中与Cas9蛋白同时存在，但是 CRISPR／Cpf1系统的作用机制与CRISPR／Cas9却有较大的不同。Cas9来源于化脓链球菌（Streptococcus pyogenes），而 Cpf1蛋白［29］来自于新凶手弗朗西斯菌（Francisella novicida）、氨基酸球菌（Acidaminococcus）和毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium），其来源更广泛，且具有更小的分子量，显示了它在包装和运输方面的优越性。CRISPR／Cas9系统需要tracrRNA与crRNA结合成RNA二聚体，并经过RNaseⅢ加工完善，方可识别目的序列，引导Cas9蛋白进行切割；而CRISPR／Cpf1系统仅需要一段42～44nt的crRNA参与即可，大大减少了实验的设计与操作流程，降低了实验的成本与风险。此外，两个系统均依靠 PAM序列对目的序列进行识别，但Cpf1识别 5′端的 TTN序列，Cas9识别 3′端的NGG序列。Cpf1蛋白剪切位点离PAM序列较远，有更多的位点供选择编辑；同时NHEJ修复时不会改变PAM临近序列，Cpf1蛋白可以再次识别与切割靶序列，提高了基因编辑的效率。而且CRISPR／Cpf1系统切割后留下粘性末端，提高了外源基因的整合效率，这在同源重组率较低的实验对象中有更大的意义。

图1 化脓链球菌CRISPR／Cas9系统结构及作用机制［26］Fig．1 Structure and mechanism of CRISPR／Cas9 system of Streptococcus pyogenes CRISPR／Cas9

图2 CRISPR／Cas9及 CRISPR／Cp f1系统示意图［30］Fig．2 CRISPR／Cas9 and CRISPR／Cpf1 system

尽管CRISPR／Cpf1技术于2015年才发现，但其目前已经在大肠杆菌（Escherichia coli）、小鼠、果蝇（Drosophila melahogaster）等多种模式生物中实现基因编辑，并且成果显著。HU等［31］于2017年初成功实现了LbCpf1对水稻基因组的编辑，发现突变率与靶基因有一定关系，而AsCpf1并不能运用于水稻编辑。2017年4月，WANG等［32］用CRISPR／Cpf1技术对水稻的编辑得出了相类似的结论，同时发现FnCpf1也可用于水稻的编辑，但效率比LbCpf1低。CRISPR／Cpf1技术还有一个重要的优势是脱靶率低。2016年，有两项研究［33－34］对 CRISPR／Cpf1技术在人体中编辑时的脱靶率做了评估，结果都表明 LbCpf1和AsCpf1在人体基因组上的潜在脱靶位点比Cas9编辑时更少，且脱靶位点的基因突变频率也低于1%，远低于靶位点的突变频率。

CRISPR／Cpf1技术在某些方面比 CRISPR／Cas9更具优势，也取得了许多相关成就，但其研究还不够深入，实际应用比较少，目前期待更多的科研工作者将其发掘改造，使其成为更适合于生物体基因编辑的工具。

3 基因编辑技术的比较

ZFNs、TALENs和 CRISPR／Cas9技术都可以进行基因编辑。理论上，ZFNs可以针对任何序列编辑，但其需要构建庞大的锌指表达文库，成本昂贵，且脱靶率很高，容易产生细胞毒性，使其应用受到限制。TALENs技术比ZFNs有所改进，但是构建周期长，成本较高，且识别位点受到胸腺嘧啶的制约，难以进行多靶点编辑。CRISPR／Cas9技术设计简单，成本低廉，构建周期短，可以进行多靶点编辑且靶向修饰效率高，但仍存在脱靶率不确定等问题。

4 CRISPR技术在水生生物中的应用

4．1 模式生物与疾病模型的构建

传统模式生物的构建依赖于ES细胞，而新型基因编辑技术的出现打破了这一局限，高效简洁的新技术甚至可以重新定义新的模式生物。斑马鱼因为其形体小巧透明，体外受精，发育迅速，成本低廉，而且其疾病生理与基因组与人类相似度高，主要信号同通路与基因具有高同源性，逐步成为仅次于小鼠的第二优先模式脊椎动物。现在有很多的科学家运用CRISPR／Cas9技术编辑改造斑马鱼基因，并且成功获得了一批基因缺失的疾病模型。比如，将斑马鱼lncRNA基因启动子敲除可以探究lncRNA基因对斑马鱼的调控，对于人类肿瘤研究具有很好的借鉴价值［35］。此外还有UROD基因敲除的人类卟啉症斑马鱼疾病模型和血红蛋白hae3基因缺失的斑马鱼模型［36］等。斑马鱼器官都具有强大的恢复能力，如果可以将基因编辑技术运用于此，以解析其再生能力的调控机制，甚至找到关键基因，无疑将成为人类器官疾病患者的福音。玻璃海鞘（Ciona intestinalis）也被视作一种海洋模式生物，目前建立的Hox基因变异与ebf基因缺失的玻璃海鞘模型，主要用于探究脊索动物身体形成的分子机制［37－38］。此外，科研工作者还建立藻类［39］等众多海洋生物模型，以此探究海洋生物的起源与进化路程，促进了海洋生命的探索与发现。

4．2 基因功能的解析与筛选

对未知基因的功能进行探索是了解生命的必要进程，但运用传统技术解析基因功能艰难而又缓慢，无法满足当今科学探索的需求。CRISPR／Cas9技术的高效切割、精确修饰使其成为基因功能解析的先进工具。许多科研工作者尝试运用CRISPR／Cas9技术对生长发育相关基因进行验证。他们发现，将斑马鱼的RFX6基因敲除后，其纯和突变体生长缓慢且无法繁育后代，证实了RFX6基因对斑马鱼胰腺发育的重要性［40］；敲除尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的dmrt1和Foxl2基因，其精巢与卵母细胞生长被抑制，验证了dmrt1和Foxl2基因对罗非鱼发育的作用［41］；运用 CRISPR／Cas9技术切除热带爪蟾（Xenopus tropicalis）six3基因，得到了six3基因参与爪蟾眼睛和大脑形成的结论［42］。随后，有科研工作者对荧光显色基因进行了研究，他们利用CRISPR技术敲除海葵（Nematostella vectehsis）的NvFP-7R基因，得到不能发出红色荧光的变异体海葵；又利用 CRISPR技术为大西洋角螺（Crepidula forhicata）添加了一段编码荧光蛋白的序列，得到了可以检测到荧光蛋白的大西洋角螺的幼 体［43－44］。针 对某些基因 的 比 较 研究，MARTIN［45］、孙晓晴［46］分析了不同甲壳动物的Hox基因，探究了其对于生物多态性的功能的异同。LIN等［47］则对太平洋海胆（Strongylocentrotus purpuratus）的众多节点基因进行了比较筛选。科研工作者们除了对小片度的未知基因进行解锁外，还在一条染色体上设计一对Cas9蛋白位点，实现了至多百万碱基的大片段切割［48］。在同一条染色体上，利用CRISPR／Cas9技术敲除大片段往往有更高的效率，有利于对基因功能的探索。

4．3 水生生物经济新品种的选育

海淡水养殖产业，尤其是鱼虾贝蟹，与人们的生活生产息息相关，而培育优质品种是促进海淡水养殖产业发展的最主要方法之一。运用新型基因编辑技术显著地缩短了育种时间，通过目的基因的切除与导入，培育了一大批优秀的转基因海产品。新型基因编辑技术不仅可以敲除基因，还可以高效、定向地导入目的基因，这项技术运用于新品种的选育，较之传统的转基因技术更加安全。这些新品种具有较快的生长速度，强大的环境适应性，创造了巨大的财富。目前，新型基因编辑技术在海淡水经济品种中的应用主要还在实验阶段，较为成功的有浅肤色的新品种大西洋鲑 （Salmo salar）［49］、青鳉 （Oryzias latipes latipes）［50］等。此外，有团队利用 CRISPR／Cas9技术编辑了脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）几丁质酶相关基因，并计划对更多的基因进行改造，以期获得更高产率的新品种［51］。这些都是目前很少的关于CRISPR应用于海洋经济品种的报告，都为水生生物经济新品种的选育提供了思路与参考。

受到“双肌牛”的启发，人们培养了一批肌肉生长抑制素基因缺失或替换的不同品种鱼，这些鱼大多具有高肌肉、低脂肪的特性，有望成为具有较高培育价值的新品种。除此之外，还可以改造基因获得一些观赏性品种，比如观赏鱼虾等。

4．4 水生生物疾病调控

除了高产量、高品质的新品种研发，还可以从疾病控制方面考虑，筛选出一批抗病、适应性强的新品种。许多疾病都与基因有关，目前已经证明CRISPR／Cas9技术可以用于识别疾病相关基因的关键调控元件［52］，这项技术运用于水生生物，可以探究其疾病发生原理，控制疾病的爆发。水产养殖中，病毒性疾病一旦爆发，难以抑制，往往造成重大经济损失，CRISPR可以记忆并识别外源入侵DNA［24］，可以以此获得免疫DNA病毒的生物体。白斑综合征一直是虾类养殖减产的最重要因素之一，将白斑综合征病毒基因的特异sgRNA和Cas9蛋白的编码序列整合到虾基因中，有望获得免疫白斑病毒的新品种虾。

4．5 海洋药物研发

海洋生物可以分泌许多具有不同生物活性的物质，其中相当一部分都有重要的药用价值，是具有理想疗效的抗肿瘤、抗病毒、抗菌药物，但其含量甚微，价格昂贵，不能满足大多数疾病患者的需求。将这些稀有昂贵的药物基因转入特殊载体或者产业化的养殖生物中表达，不仅可以获得药物，而且可以提升产量，解决了药物不足，价格昂贵等问题。已有科研工作者尝试将相关基因提取出来，运用CRISPR／Cas9技术导入海藻等超大规模养殖生物，或获得指定类型的斑马鱼胚胎和幼苗进行了小分子药物筛选，以解决部分海洋药源问题［53］。在海洋新药研发过程中，最重要的是药物与靶点之间的验证，而耐药性突变位点往往与靶点有重要的关联，因此可以在野生型背景的细胞中引入耐药性突变点，以此验证靶点的可靠性［54］，同时将 CRISPR／Cas9技术与全基因组测序及耐药性突变筛选结合，大大提高了靶点验证的效率［55］。

5 问题与展望

新型基因编辑技术的出现再次激发了生物研究科技工作者们在基因水平改造生物的研究热情，但其还远未尽善尽美。首先，新型基因编辑技术本身还存在技术上不完善的地方，如经CRISPR／Cas9基因编辑后的小鼠经全基因组检测表明存在上千个无法控制的预测和控制的突变［56］，即 使 CRISPR／Cpf1 系 统 脱 靶 率 比CRISPR／Cas9低，但也容易产生嵌合体；其次，新型基因编辑技术的应用还受到材料本身的很多限制，如对水生生物的甲壳类生物而言，显微注射后的卵在孵化成功率上还有待进一步提高［51］。任何技术都是从不完善慢慢走向成熟和完善，我们有理由相信，在众多科研工作者们开始大量展开新型基因编辑技术应用的过程中，上述问题会逐步得到有效地解决。