刺参粗多糖保护线粒体及其作用机制

韦豪华,张红玲,李兴太

(大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600)

线粒体(Mitochondrion,MT)作为真核细胞中最重要的细胞器之一,具有提供能量、产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)及调控细胞凋亡三大生物学功能,在细胞的生长、发育、凋亡和衰老的过程中,发挥着十分重要的作用[1],其不仅作为生命活动的枢纽和核心,同时也是活性氧(ROS)的主要来源和自由基损伤最敏感的靶部位,而这些ROS又与健康长寿有着十分密切的关系[2-4]。许多文献表明,MT的功能状态在很大程度上决定了细胞的生死存亡[5]。MT功能紊乱被证实和许多人类常见疾病相关,如糖尿病、心脏病、肿瘤、神经退行性改变和衰老等[6]。另外,ROS水平的失调是引起MT发生损伤的主要途径之一[7]。ROS由机体的正常耗氧如呼吸及某些细胞所介导的免疫功能连续产生[8],ROS的生成与清除(由抗氧化酶和抗氧化剂)之间保持平衡(氧化还原平衡)对健康具有十分重要的意义[9]。在线粒体自由基衰老理论中[10],这些ROS是蛋白质、脂质和核酸损伤的主要原因[11]。此外,研究表明MT与癌症之间有着密切的联系。ROS对调节正常细胞过程很重要,其过量或不足所致的氧化还原失衡是疾病发病机制的诱因,包括癌症的发生和进展,ROS与细胞氧化应激被认为是癌症发生的诱导物[12]。对于如何清除与调节线粒体活性氧对保护MT具有十分重要的意义,寻求更加有效且天然的抗氧化剂与研发防癌保健产品也成为了研究的热门与重点。

刺参是海参的一种,刺参(Stichopusjaponicus)属棘皮动物门、海参纲、刺参科生物,被誉为参中之冠。本草中记载“刺参有补肾益精、养血润燥、止血消炎之功效”。刺参多产于中国的山东和大连。其含多糖、皂苷、胶原蛋白、多肽和氨基酸等成分[13]。刺参多糖是刺参的重要活性成分之一,刺参多糖主要存在于刺参的体壁中,研究表明[14]刺参多糖中的单糖以岩藻糖、氨基半乳糖、葡萄糖醛酸为主,其对调控人体生理功能等具有非常重要的意义,主要表现在抗肿瘤、抗凝血、抗血栓、抗血脂、抗氧化以及增强免疫等活性作用[15]。而目前对刺参多糖在各方面的药理作用研究比较广泛,但是对其在MT保护方面的研究与报道比较少。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级SD雄性大鼠(合格证号:2007 6A007) 6只,六周龄,体重190～220 g,由大连医科大学实验动物中心提供;干刺参 购自大连晓芹食品有限公司;木瓜蛋白酶(Papain Papaya,80万U/g) 北京索莱宝科技有限公司;氯化十六烷基吡啶(CPC) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;硫代巴比妥酸(TBA)、1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP) 美国Sigma公司;菲洛嗪(Ferrozine) 英国Alfa Aesar公司;氮蓝四唑(NBT)、牛血清白蛋白 荷兰Boehringer Mannheim 公司;考马斯亮蓝G-250、吩嗪硫酸甲酯(PMS) 美国Fluka 公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris) 美国Gibco公司;N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES) 德国Merck公司;三氯乙酸(TCA)、乙酸钠、半胱氨酸盐酸盐 天津市科密欧化学试剂有限公司;还原型辅酶I(NADH) 上海源叶生物科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 天津市化学试剂一厂;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT) 国药集团化学试剂有限公司;其他试剂 均为国产或进口分析纯。

UV-24520紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;KQ-50E超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;XW-80A旋涡混合器 上海精密实业有限公司;DY89-1型电动玻璃匀浆机 宁波新芝科器研究所;TGL-18M台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;水浴恒温振荡器 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SJCP的提取及其多糖含量的测定 精确称取10 g刺参干粉,加入60 mL丙酮溶液,于4 ℃浸泡24 h,取出挥干。向挥干的刺身干粉中加入1 g木瓜蛋白酶和300 mL 0.1 mol/L的乙酸钠缓冲液(pH6.0,含EDTA和半胱氨酸盐酸盐的浓度为5 mmol/L),置于60 ℃中水浴24 h。取出冷却后,10000 r/min离心5 min,收集上清液。向上清液中加16 mL 10%的CPC溶液,充分搅拌后静置24 h,待分层后在6000 r/min离心20 min,收集沉淀。用20 mL NaCl乙醇溶液(3 mol/L NaCl溶液∶乙醇=100∶15 v/v),将沉淀完全溶解。向溶解液中加入40 mL 95%乙醇溶液,此时溶液呈红褐色,充分搅拌之后于4 ℃ 静置过夜。待溶液分层后便可取出,在6000 r/min离心20 min,离心之后得到粗多糖沉淀,再用80%和95%乙醇溶液清洗该沉淀2～3次后,60 ℃烘干2 h,即可得到SJCP。然后采用硫酸苯酚法[16]测定SJCP的多糖含量。

1.2.2 肝线粒体的制备 利用差速离心法分离大鼠肝线粒体[17],从处死的大鼠体内取出肝脏,用预冷的生理盐水将血迹清洗,然后将鼠肝放入预冷的分离介质(含有0.5 mmol/L EDTA、0.25 mol/L 蔗糖、3 mmol/L HEPES,pH7.4)中在匀浆器中进行匀浆,结束后将其放入台式高速冷冻离心机中于4 ℃,1000×g离心10 min,然后取上清液放入新的离心管中,在12000×g离心10 min,弃上清取沉淀并将沉淀研开,再加分离介质后于12000×g离心10 min,重复上一步,最后得到的沉淀即为线粒体,加一定分离介质制成悬液后于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量的测定 MDA是线粒体脂质过氧化的终产物,本实验采用TBA显色法对MDA的含量进行测定[18]。反应体系分为调零管、空白管、对照管以及样品管,包含有5 mmol·L-1FeSO4和6 mmol·L-1的维生素C(VC)(空白管不加FeSO4和VC),以及不同浓度(0.003、0.007、0.013、0.027 mg/mL)的SJCP(对照管不加)和100 μL的线粒体悬液,再用pH7.4、0.1 mol·L-1的磷酸盐缓冲液(PBS)补充体积到2 mL,在37 ℃水浴60 min,取出后再加入0.5 mL 20%的TCA结束反应,随后分别倒入离心管后在5000×g条件下离心10 min,结束后取2 mL上清液,然后再加1 mL 0.67%的TBA,在100 ℃条件下煮沸10 min,调零管只加3 mL PBS用于调零,于532 nm处测定其吸光度A,最后以1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP)含量作为外标,回归后分析计算MDA的含量。SJCP的作用以对MDA的抑制率(IR)用公式(1)进行计算。

MDA IR(%)=(MDA含量对照-MDA含量SJCP)/(MDA含量对照-MDA含量空白)×100

式(1)

1.2.4 Fe2+的螯合能力 本实验将试管分为空白、对照、阳性对照及样品组,在试管中按顺序加入不同浓度的EDTA溶液(0.6 mg·mL-1)或SJCP溶液、0.1 mL 0.375 mmol·L-1FeSO4溶液、0.1 mL 2.25 mmol·L-1Ferrozine,最后均用Hepes缓冲液将体积补充到3 mL,旋涡混匀后,室温静置20 min,于562 nm处测定吸光度A,以EDTA为阳性对照,所得结果以螯合率表示[19],按公式(2)计算。

Fe2+螯合率(%)=[(A对照-ASJCP或EDTA)/A对照]×100

式(2)

式(3)

1.2.6 羟自由基(·OH)清除能力的测定 Fenton反应体系包含7.5 mmol·L-1硫酸亚铁、5 mmol·L-1邻二氮菲、0.2 mmol· L-1PBS和不同浓度的SJCP、1%的H2O2。实验分成调零、空白、对照、阳性对照及样品管,以BHT为阳性对照,各管在加入H2O2之后开始反应,均放在37 ℃水浴60 min,测定536 nm处Fe2+-邻二氮菲复合物的吸光度值[21]。SJCP对·OH的清除能力通过公式(4)计算。

·OH SR(%)=(A1-A0)/(A2-A0)×100

式(4)

式中,A0为对照;A1为SJCP或者BHT;A2为空白。

1.2.7 过氧化氢(H2O2)清除能力的测定 本实验分为对照组、阳性对照组和样品组共三组,SJCP对H2O2的清除作用根据Zhao等[22]方法测定。0.1 mmol·L-1H2O2与1.0 mL不同浓度的SJCP或 0.5 mg/mL的BHT混合,再加入50 μL 3%钼酸铵、5 mL 2 mol/L硫酸和3.5 mL 1.8 mol/L碘化钾。配制完成静置3 min后采用滴定法,用5 mmol·L-1的NaS2O3溶液滴定各组样品至黄色消失为止,本实验需记录滴定前后NaS2O3溶液的体积,得出消耗体积为最终结果。用BHT作为阳性对照,最后结果用清除率表示,按公式(5)计算:

H2O2SR(%)=[(V对照-VSJCP或BHT)/V对照]×100

式(5)

1.2.8 还原力的测定 以BHT为阳性对照,取不同浓度的SJCP于试管中,加入0.5 mL 0.2 mol/L、pH6.6的PBS缓冲液和0.5 mL 1%铁氰化钾溶液,加去离子水补足至1.5 mL,于50 ℃水浴20 min后取出冷却,再加入1.0 mL 10% TCA,5000 r/min离心5 min,然后取上清1.5 mL,再分别加入0.1 mL 0.1%的FeCl3溶液,最后加水补足至2 mL,漩涡混匀后静置10 min,测定700 nm处吸光值,吸光度越大,则表示其还原力越强[23]。

1.3 统计学处理

2 结果与分析

2.1 SJCP的多糖含量分析

刺参多糖作为刺参的有效活性成分之一,具有抗肿瘤、抗氧化等非常重要的药理作用。因此,其有可能参与机体的能量代谢,而且刺参多糖的含量高于其他海参种类,多糖组分中岩藻糖和硫酸基的比例亦高于其他海参,硫酸化程度较大,硫酸基的含量占多糖含量的30%左右[24],本实验以葡萄糖作为标准品,采用硫酸苯酚法[16]来测定SJCP的多糖含量,回归后得到的多糖含量的标准曲线为y=0.0711x-0.00007,由此算出SJCP的多糖含量为30%,而考虑到硫酸基的影响,实际上SJCP中的多糖含量约为60%左右。

2.2 SJCP对鼠肝线粒体MDA生成的影响

MDA是脂质过氧化(Lipid Peroxidation,LPO)的最终产物,脂质在Fe2+的作用下会产生MDA,其在体外会影响MT呼吸链复合物及MT内关键酶活性。另外,LPO可通过对线粒体膜、膜蛋白及线粒体DNA的作用导致线粒体损伤,而线粒体损伤及功能障碍与很多疾病有关[25]。由表1可知,用Fe2+/Vit C 系统处理鼠肝MT后,产物MDA含量明显增多,SJCP对MDA生成的抑制作用随着其质量浓度的增加逐渐增强。当达到一定的质量浓度即在SJCP浓度为0.027 mg/mL时,其抑制率较高达到48.36%,与对照组进行比较存在极显著性差异(p<0.01),说明SJCP具有一定的抗氧化活性,能够在一定程度上抑制MT发生LPO。丙二醛(MDA)是有机化合物,并且是氧化应激的标记物。ROS降解多不饱和脂质,形成MDA[26]。在后面的实验中也证明了SJCP能够清除一些主要的ROS自由基,而且SJCP与金属螯合能力是显著的,具有良好的抗氧化能力,也很好地说明了SCJP对LPO的抑制作用。

表1 SJCP对鼠肝线粒体MDA生成的影响Table 1 Effect of SJCP on MDA generation

2.3 SJCP对Fe2+螯合能力的影响

铁和过氧化氢反应生成羟自由基后所进行的一系列反应称之为Fenton反应。Fe2+螯合力测定的原理则是在这个反应之前,通过金属螯合会使过渡金属酶的浓度下降,阻止ROS的过量产生,防止脂质过氧化的发生。所以,Fe2+螯合力测定在抗氧化性能测定中十分重要。由表2可知,随着SJCP质量浓度的增加,其对Fe2+的螯合率也随之增大,在SJCP质量浓度为0.033 mg/mL时,其吸光度与对照组相比有显著性差异(p<0.05),此时其螯合率仅为6.53%;当SJCP质量浓度为0.333 mg/mL时,其吸光度与对照组相比有极显著性差异(p<0.01),此时螯合率可达到30.86%,而与EDTA对Fe2+的螯合率相比则相对较弱,说明SJCP具有一定的螯合能力。金属螯合又是一种重要的抗氧化特性[27-28]。金属螯合能力是极显著(p<0.01)的,其减少了在LPO中起催化作用的过渡金属的浓度。另外,含有以下两个或更多个官能团结构的化合物:-OH、-SH、-COOH、-PO3H2、C=O、-NR2、-S-和-O-,是有利的结构-功能构型,可显示出金属螯合活性[29-30]。而SJCP就含有-OH、C=O、-S-等官能团,因此具有一定的金属离子螯合能力。

表2 SJCP对Fe2+螯合能力的影响Table 2 Effect of SJCP on Fe2+

2.4 SJCP对的影响

表3 SJCP对的清除作用Table 3 Scavenging effect of SJCP against

表4 SJCP对·OH的清除作用Table 4 Scavenging effect of SJCP against

表5 SJCP对H2O2的清除作用Table 5 Scavenging effect of SJCP against

2.5 SJCP对还原力的影响

研究表明,物质的还原力越强,其抗氧化性就越强。在氧化还原反应中,物质能提供出电子而自身发生氧化的能力称为还原力,是作为物质抗氧化活性的一个重要表现[36]。在实验中,通过还原Fe3+来测定SJCP的还原力,吸光度越高还原力越大,由表6可知,SJCP的还原力随着质量浓度的增大而增强,但和BHT组相比较弱。另外,还原力大的物质可作为良好的电子供体,提供的电子不仅能够将Fe3+还原为Fe2+,而且可与自由基结合使其成为更稳定的物质[37]。这也是SJCP这种外源性抗氧化剂抑制LPO进而保护MT的可能机制之一。

表6 SJCP对还原力的影响Table 6 Effect of SJCP on reducing

3 结论

本实验研究结果表明,SJCP能够在一定浓度范围内很好地抑制线粒体MDA的生成,说明其能够防止机体脂质过氧化的发生。而且SJCP具有一定的Fe2+螯合能力和还原力,更重要的是其能很好地清除3种主要的ROS,并随着质量浓度的增大清除能力也增强,但远不如BHT强,说明其具有温和的抗氧化作用。因此,SJCP可能通过一定的Fe2+螯合能力和还原力、温和的抗氧化作用保证机体的氧化还原平衡,保护MT进而预防癌症的发生。随着近年来对海参研究的深入,发现海参不仅仅可以作为上等的美味,而且在功能保健及疾病预防等方面发挥着重要的作用。刺参多糖作为刺参的重要活性成分之一,其多糖结构特殊,同时具有许多人工合成类药物所不具备的药理作用,结合近年来国内外学者对如何保护线粒体预防一些疾病研究的热度而言,未来或许可以从保护MT的角度对刺参多糖有更深入的研究,从而研发出能以刺参多糖为主要功能因子的更好防治癌症等一些疾病的良药。