呕吐毒素时间分辨荧光免疫层析法的建立与评价

张东升,严艺琳,熊晓辉,董曼佳,游京晶,张一平

(1.江苏省苏微微生物研究有限公司,江苏无锡 214063; 2.南京工业大学食品与轻工学院,江苏南京 211800)

呕吐毒素,又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是一种由小麦赤霉病菌、禾谷镰刀菌复合群产生的单端孢霉烯族化合物[1]。据报道,小麦赤霉毒素爆发频率增加,DON成为小麦增产与质量安全的主要威胁,尤其是我国长江流域、黄河流域等重要冬麦区[2-3]。1998年,在国际癌症研究机构公布的评价报告中,DON被列为第3类致癌物,对人类及动物的健康构成了威胁[4]。欧盟要求供人食用的玉米、燕麦小麦中DON含量为低于1.75 mg/kg[5];国内要求谷物及其制品的DON限量为1.0 mg/kg[6]。

目前,DON的检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)[7-8]、胶体金免疫层析法(GICA)[9-10]和高效液相色谱法(HPLC)[11-12]。其中ELISA法虽操作简单、灵敏度高,但不适合现场检测,且假阳性率高;GICA法虽然适合现场检测,但灵敏度低,但不能准确定量。HPLC为国标第二法,前处理需免疫亲和柱净化,成本高、时间长。荧光定量免疫层析是以镧系元素铕的螯合物纳米微球为荧光探针,并结合医学床边检验(POCT)的免疫层析技术[13-16],该法因简便、灵敏度高及准确定量等特点,而被广泛应用。

针对粮食收购、储运及加工等环节,急需快速、灵敏、准确检测DON的方法。近年来,高雷等[17]建立了高灵敏DON时间分辨荧光试剂盒的方法,虽灵敏度很高,但检测时间长,且需要昂贵的96孔时间分辨荧光仪;肖理文等[18]对DON时间分辨荧光层析卡的技术性能进行了初探,但制备环节不详。本文依据免疫竞争抑制法构建了DON时间分辨荧光免疫层析方法(TRFIA),重点探讨层析卡制备中微球标记的单抗浓度及TRFIA应用条件,环境温度、层析时间、加样体积及缓冲体系;同时评价该方法的灵敏度、准确度及精密度。以期建立适用于谷物及其制品中DON的快速定量方法,保障粮食、食品的质量安全。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

呕吐毒素标准品(纯度≥98%)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA) 美国Sigma公司;DON-BSA偶联物 本实验室制备并纯化,DON与BSA偶联比约10∶1,浓度5.8 mg/mL;抗DON单抗细胞株SW-3 F4 本实验室筛选并冻存,单抗亚型IgG1、间接ELISA IC50为90 ng/mL、亲和常数3.1×108L/mol、抗DON单抗与DON、15-Ac-DON、3-Ac-DON及NIV的交叉反应分别为100%、215%、<0.1%,纯度95.4%,蛋白浓度4.3 mg/mL;羊抗鼠IgG 上海康成生物工程有限公司;铕纳米微球 平均粒径90 nm,表面活性基团-COOH,激发365 nm、发射612 nm,Bangs Laboratories,Inc.;玻璃棉、硝酸纤维素膜(135s) 德国Merck Millipore;玉米、玉米面、小麦、面粉、面包、大麦 江苏省粮食局粮油质量监测所;HP-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm) 美国赛芬科技公司;DON及其乙酰化衍生物亲和柱 江苏省苏微微生物研究有限公司。

SW-2时间分辨荧光检测仪 江苏省苏微微生物研究有限公司;GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;HS-3垂直混匀仪 宁波新芝生物科技股份有限公司;DZF-6030B真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;HM3035三维划膜喷金仪、CTS300数控裁条机、ZQ2000自动斩切机 上海金标生物科技有限公司;LC-20AT液相色谱仪 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 时间分辨荧光免疫层析卡的制备[19]

1.2.1.1 抗DON单抗的荧光纳米微球标记 Mes溶液(0.05 mol/L,pH6.0):称量2-(N-吗啉)乙烷磺酸9.76 g、29.22 g NaCl、5 mL 10% 的十二烷基聚乙二醇醚，溶于1 L蒸馏水,并用3 mol/L NaOH调节pH6.0;硼酸缓冲溶液(0.05 mol/L,pH8.0):A液:0.2 mol/L硼酸:1.237 g硼酸加100 mL水,B液:0.05 mol/L硼砂:1.907 g硼砂加100 mL水,以A∶B液体积比7∶3混合,再用水稀释4倍。取待标记单抗用硼酸缓冲溶液(0.05 mol/L,pH8.0)4 ℃透析过夜备用。取400 μL硼酸缓冲溶液于2 mL离心管中,加入100 μL荧光微球,漩涡振荡,混匀,加入20 μL的EDC(10 mg/mL)Mes溶液(0.05 mol/L,pH6.0)。室温振荡活化15 min后,于10 ℃、10000 r/min离心10 min,弃上清,用0.5 mL硼酸缓冲液复溶。加入抗DON单抗,使终浓度为50～200 μg/mL。室温下垂直混匀仪上反应2 h。再加入1/10体积含10% BSA的硼酸缓冲溶液,于垂直混匀仪上继续反应2 h。离心洗涤2次,10 ℃、10000 r/min离心10 min,弃上清,用0.5 mL硼酸缓冲液复溶;最后一次洗涤离心后,用含1% BSA的硼酸缓冲液重悬,置于4 ℃保存备用。

1.2.1.2 层析膜、结合垫及样品垫的制备 a:层析膜:将硝酸纤维膜切成2.5 cm×30 cm的长条,置三维划膜喷金仪平台上;用含5%甲醇的PBS(0.01 mol/L,pH7.2)将制备的DON-BSA抗原,稀释至0.5～1.5 mg/mL,羊抗鼠IgG稀释至1.0 mg/mL,分别放于存储池A和B;以1 μL/cm分别将上述溶液喷点于检测膜中央,形成检测线和质控线印迹,两者相距0.5 cm;置37 ℃真空干燥箱60 min,将层析膜置塑料袋,4 ℃密闭保存备用。

b:结合垫:将玻璃棉切成1.5 cm×30 cm的长条,置三维划膜喷金仪平台上;取0.5 mL纳米微球标记物,加入不同体积比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)含1% BSA、3% 蔗糖、0.6 mol/L NaCl、0.2% Tween-20和叠氮化钠的硼酸缓冲溶液(0.05 mol/L,pH8.0)稀释;利用喷头以15 μL/cm,将上述溶液喷点于玻璃棉;置42 ℃真空干燥箱60 min,将玻璃棉置塑料袋,保存方法同1.2.1.2 a中所述。

c:样品垫:将玻璃棉切成1.5 cm×30 cm的长条,浸泡于含0.1 mol/L NaCl、0.2% Tween-20和0.1%叠氮化钠的PB溶液(0.01 mol/L,pH7.2);保存方法同1.2.1.2a中所述。

1.2.1.3 荧光免疫层析卡的组装 以PVC胶粘板作衬板,将层析膜粘贴在衬板的中央。将样品垫、结合垫依次粘贴在层析膜的左端,将吸水垫粘贴在层析膜的右端,并且两垫之间有1～2 mm的交联。将组装好的试剂板用自动斩切机切割成长60 mm、宽3 mm的板条,装于塑料卡壳中。

1.2.2 测定条件的优化

1.2.2.1 测定过程 将DON的标准品用50%甲醇定容,配制成1000 ng/mL的标准储备溶液;采用一定缓冲体系配,制成0、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25 ng/mL标准工作液。调节一定温度,将层析卡及系列标准溶液分别平衡至该温度下,准确移取一定体积标准工作液,加于层析卡的样品孔中,使层析卡于相应温度下反应一定时间,每个浓度做3次平行测试。由低浓度到高浓度进行检测,时间分辨荧光仪检测T线荧光强度与C线荧光强度,计算T/C值。以标准工作液浓度的自然对数值(lnC)为横坐标,各浓度标准液的T/C值与0 ng/mL标准液的T/C值的比值(以下采用B/B0表示,%)为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.2.2 缓冲体系对标准曲线的影响 用PBS(0.01 mol/L,pH7.2)、PBS(0.05 mol/L,pH7.2)、含5% 甲醇的PBS(0.01 mol/L,pH7.2)分别配制系列标准溶液,调节温度至20 ℃,将层析卡及系列标准溶液平衡至该温度下,移取100 μL加于层析卡的样品孔中,该温度下反应10 min。按1.2.2.1中所述方法绘制标准曲线,比较斜率、截距及IC50。

1.2.2.3 环境温度对标准曲线的影响 以PBS(0.01 mol/L,pH7.2)为缓冲体系,调节温度至10、20、30 ℃,将层析卡及系列标准溶液分别平衡至该温度下,移取100 μL标准工作液加于层析卡的样品孔中,使层析卡于相应温度下反应10 min。按1.2.2.1中所述方法绘制标准曲线,比较斜率、截距及IC50。

1.2.2.4 加样体积对标准曲线的影响 以PBS(0.01 mol/L,pH7.2)为缓冲体系,调节温度至20 ℃,将层析卡及系列标准溶液分别平衡至该温度下,分别移取50、100、200 μL标准工作液加于层析卡的样品孔中,使层析卡于相应温度下反应10 min。按1.2.2.1中所述方法绘制标准曲线,比较斜率、截距及IC50。

1.2.2.5 反应时间对标准曲线的影响 以PBS(0.01 mol/L,pH7.2)为缓冲体系,调节温度至20 ℃,将层析卡及系列标准溶液分别平衡至该温度下,移取100 μL标准工作液加于层析卡的样品孔中,使层析卡于相应温度下反应10、15、20 min。按1.2.2.1中所述方法绘制标准曲线,比较斜率、截距及IC50。

1.2.3 标准曲线的绘制 将DON的标准品用50%甲醇定容配制成1000 ng/mL的标准储备溶液;采用PBS(0.01 mol/L,pH7.2)稀释成0、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、25、50、100 ng/mL浓度标准工作溶液。按1.2.2筛选的最佳条件进行测定,绘制标准曲线,并确定线性范围。

1.2.4 样品处理 准确称取5 g混合均匀的玉米等6种典型样品(已粉碎),置于锥形瓶中,加入50 mL水,摇床剧烈振荡30 min,用快速定性滤纸过滤。准确移取50 μL滤液加入950 μL样品稀释液,混匀,按照1.2.2筛选的最佳测定条件进行,最后将层析卡放入时间分辨荧光检测仪中,即时测量。由标准曲线上查出相应的剂量浓度,并乘以相应的稀释倍数来定量。

1.2.5 方法学评价

1.2.5.3 精密度 精密度是衡量试纸条的批内差和批间差的重要指标,选择低、中、高3种浓度的DON标准品溶液,采用不同批次的测试卡,10次重复试验,计算批间和批内变异系数(CV)。

1.2.5.4 准确性 a.加标回收试验:采用空白基质样品添加回收试验,在小麦、玉米样本中分别加入低、中、高浓度的DON标准品,根据时间分辨荧光检测仪T/C值和标准曲线得出检测浓度。加标回收率(%)=(实测浓度-空白浓度)/加标浓度×100。

b.与IAC-HPLC法对比试验:选取玉米、玉米面、小麦、面粉、面包、大麦等6种典型样本24份,按1.2.4方法处理,同一份样液分别采用DON荧光层析卡和IAC-HPLC[11]法进行测定。结果对比分析,进一步验证该方法与国家标准GB 5009.111第二法的一致性。

1.3 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2010处理数据、绘图。

2 结果与分析

2.1 荧光微球标记单抗

2.1.1 单抗标记浓度及人工抗原划膜质量浓度的确定 固定二抗划膜条件,考察了NC膜上3种不同包被DON-BSA抗原质量浓度、与3种不同单抗浓度(以标记溶液的终浓度来表示)标记的微球制成层析卡,以PBS(0.01 mol/L,pH7.2)为缓冲体系配制DON标准溶液。选择本底荧光值较低、荧光值梯度好,且T线与C线比值在1.0～1.5之间的作为划膜浓度及标记抗体时的最佳稀释浓度。结果表明(见表1),标记溶液单抗终浓度100、200 μg/mL对于DON不同浓度的抑制率相当,但单抗用量小,确定划膜浓度1.0 mg/mL,100 μL荧光微球标记的单抗终浓度为100 μg/mL,即50 μg。

表1 划膜质量浓度与标记单抗终浓度的确定Table 1 The determination of the concentration of the film and the final concentration of the marker

2.1.2 标记单抗微球的稀释倍数优化 采用荧光微球标记的单抗与不同缓冲溶液体积比混合,制成层析卡。结果见表2,选取T/C比在1.0～1.5,且各浓度标准液的T/C值与0 ng/mL标准液的T/C值的比值为5%～75%。确定微球体积与缓冲液按照1∶4进行混合喷于结合垫为佳。

表2 不同标记单抗的微球稀释倍数的确定Table 2 The determination of microspheres dilution multiple of different markers

2.2 测定条件的确定

2.2.1 缓冲体系对标曲IC50的影响 从图1、表3结果可以发现,5%的甲醇PBS(0.01 mol/L,pH7.2)和PBS(0.01 mol/L,pH7.2)对测定灵敏度、IC50、绝对系数、斜率几乎完全一致,曲线完全重叠。含有一定有机溶剂的缓冲体系对于采用有机溶剂提取多毒素后,仅通过一定稀释即可满足测定的需求。而当离子强度增加到0.05 mol/L时,曲线的线性不易控制,且平行性差,所以选择5%的甲醇PBS(0.01 mol/L,pH7.2)作为最佳缓冲体系。

图1 不同缓冲体系对标曲IC50的影响(n=3)Fig.1 The effect of different buffer systems on the standard curve IC50

2.2.2 环境温度对标曲IC50的影响 不同温度下得到的直线如图2、表3所示。浓度从0.5～25 ng/mL,仅20 ℃条件下曲线的决定系数R2>0.99,要达到R2>0.99,则10 ℃条件下线性范围为0.5～10 ng/mL,30 ℃条件下线性范围为1～25 ng/mL。随温度的升高,曲线的斜率变大,IC50变大,层析卡灵敏度降低至1.0 ng/mL,对于同一个样品随着温度的升高,样本的测定值偏低。从0.5 ng/mL浓度的抑制率来看,低温下仅55%,虽灵敏度较高,但是从控温的角度不太容易,考虑到现场以及一般实验室最容易达到的环境温度,最佳选择(25±2) ℃,且使用标准溶液在即时环境下进行标准曲线的温度校正,以保证测定值的准确性。而肖理文[15]报道的反应温度采用37 ℃恒温反应,虽然是抗体、抗原最佳的反应温度,但是较高的温度使得灵敏度降低,不利于检测方法的开发,其次控温37 ℃不利于现场的操作。

图2 不同反应温度对标曲IC50的影响(n=3)Fig.2 The effect of different reaction temperatures on the standard curve IC50

2.2.3 加样体积对标曲IC50的影响 图3、表3显示,当加样体积为50 μL,高浓度的抑制率并不明显,原因最大可能是随着爬膜的进行,液体体积变少,抗原抗体的反应不完全,特别是C线处的荧光强度变弱。当加样体积增加至100、200 μL时,结果显示两条标准曲线基本相近,IC50差异小,100 μL加样体积既能满足抗原抗体充分反应的溶液状态,且不溢出平行性好。而200 μL会因加样体积过大溢出加样孔,特别当低浓度测定时,致使加样浓度出现偏差,因此选择100 μL作为最佳的进样体积。

图3 不同加样体积对标曲IC50的影响(n=3)Fig.3 The effect of different adding volumes on the standard curve IC50

表3 不同测定条件下的曲线方程、绝对系数及标曲IC50Table 3 The results of different measurement conditions on the equations，absolute coefficients and standard curve IC50

2.2.4 反应时间对标曲IC50的影响 免疫荧光微球随着时间不断涌动,仪器监测到的T/C值是一个动态变化过程,因此设置信号稳定的时间为最佳的检测时间[22]。在不同反应时间下,所得出的标准曲线如图4、表3,反应时间由10 min增加至20 min,同一标准点的T/C基本稳定,三条标准曲线几乎完全重合,考虑到免疫层析快速简便的特点,将最佳检测时间确定为10 min。

图4 不同反应时间对标曲IC50的影响(n=3)Fig.4 The effect of different reaction time on the standard curve IC50

2.3 标准曲线及线性范围

由图5可以发现,横坐标采用的是浓度的自然对数,通过绘制得到的依然是平滑的S曲线,这与免疫竞争得到的曲线是一致的[20];同时在0.5～25 ng/mL浓度范围内,有效剂量值即抑制率在76%～10%,线性回归相关系数r=0.9992,直线方程y=-0.1723x+0.6442。由此,确定标准曲线的线性范围为0.5～25 ng/mL。

图5 不同浓度(0.1～100 ng/mL)下的标准曲线(n=5)Fig.5 Standard curve of the different concentrations(0.1～100 ng/mL)(n=5)

2.4 方法学评价

Li等[23]研究显示,在标记相同抗体密度下,100 nm胶体金探针显示与抗原结合的亲和力最高,且在竞争免疫层析试纸条中灵敏度最好。因此,研究采用的微球平均粒径比肖理文等[18]采用的微球210 nm小了近1半,有助于提高标记抗体与抗原的结合,提高灵敏度。但从层析卡制备的工艺上看,本研究建立的层析卡,规格是60 mm×3 mm,而肖理文等采用的90 mm×5 mm,即加样孔的位置离检测线越远,层析膜越宽,则免疫标记复合物通过检测线的时间越滞后,反应时间相对增加,有助于其灵敏度的提高[18]。因肖理文报道中,并未提及原料单抗的IC50值,在不考虑DON单抗IC50不一致的情况下,最终灵敏度与肖理文等报道的灵敏度相当,较熊齐荣等[9]、黄志兵等[10]建立GICA的灵敏度分别提高了400倍、200倍。

2.4.2 方法检出限及定量限 对小麦、玉米空白基质的测定结果如表4,根据1.2.5.2的公式计算,小麦与玉米的检出限和定量基本一致。该方法小麦的检出限为69.5 μg/kg,定量限为192.7 μg/kg,相比熊齐荣等[9]、黄志兵等[10]建立GICA的检出限分别提高了7.2倍、14.4倍,与肖理文等[18]建立的层析卡检出限和定量限(25、82 μg/kg)优势不明显。究其原因主要在于样品的稀释倍数不同,本方法稀释倍数为200,而肖理文等仅稀释了55倍。较大的稀释倍数优势在于,第一有利于降低样品中干扰物质的浓度;第二提取多毒素时,常采用高浓度有机相,有利于降低有机溶剂的浓度,减小对免疫结合的干扰。

表4 小麦、玉米检出限(LOD)及定量限(LOQ)Table 4 LOD and LOQ of TRFIA in wheat and maize

2.4.3 精密度 分别采用不同批次的荧光层析卡对低、中、高3种浓度的DON标准品进行10次定量检测,批内和批间CV值分别为3.82%～5.97% 和5.22%～10.15%(表5),批内和批间CV均小于11%,说明荧光层析卡均一性良好。

表5 荧光测试卡检测DON的精密度试验(n=10)Table 5 Precision test of fluorescence immunochromatographic card to detect DON(n=10)

2.4.4 准确性

2.4.4.1 加标回收试验 根据检出限和定量限,设定了4个浓度,涵盖了检出限、定量限和高浓度的加标回收测定。分别对阴性小麦及玉米进行不同水平的DON加标,加标浓度分别为200、500、1000及2000 μg/kg,TRFIA重复测定5次,计算平均回收率在91.4%～109.3%(见表6)。

表6 小麦、玉米不同浓度加标回收率(n=5)Table 6 The recovery at different concentrations in wheat and maize(n=5)

2.4.4.2 与IAC-HPLC法对比 将两种方法对24份典型样品的检测结果进行线性回归分析,结果如图6。两种方法的线性相关系数r=0.9754,结果高度相关,具有良好的一致性。但从原料单抗与DON类似物的交叉,可以发现,单抗与15-Ac-DON有215%的交叉,即样品中含有15-Ac-DON则同样被检出,测定的结果应是DON和15-Ac-DON的总量。而层析卡的结果与HPLC呈现出高度的一致性,更说明了样品中15-Ac-DON的含量很低,且HPLC测定中发现的 3-Ac-DON、NIV不影响TRFIA对DON的准确定量。这与史建荣[2]调查结论基本一致,调查发现长江流域的12个省份采集的231个F.asiaticum的菌株中,3-Ac-DON化学型占67%,NIV化学型占23%,15-Ac-DON化学型仅有10%。由此可见,所建立的时间分辨荧光免疫分析法能满足DON定量需求。

图6 HPLC与TRFIA测定样品中DON的相关性Fig.6 The correlation analysis of HPLC and TRFIA for determination of DON in different samples

3 结论

采用包裹有镧系元素(Eu)螯合物的荧光纳米微球作为单抗的标记示踪物,建立了DON时间分辨荧光免疫层析方法。每100 μL荧光微球结合纯单抗50 μg,最佳划膜浓度为1.0 mg/mL;灵敏度为0.25 ng/mL,检出限69.5 μg/kg,测量范围为100～5000 μg/kg,基本满足了绝大多数谷物及其制品的检测。采用IAC-HPLC法同时检测小麦、面粉、玉米等24份样品,并检测到3-Ac-DON、NIV,但15-Ac-DON含量极低,所建立的TRFIA与其具有良好的一致性。

荧光免疫层析卡操作简单,谷物及其制品仅需简单提取并稀释,室温下10 min即可得出结果;配套小型时间分辨荧光检测仪,适合基层单位现场大量样本毒素指标的定量,具有非常好的推广应用价值。DON层析卡在粮油中得到较好的应用,但对于食品和饲料中的检测,还需确定其适用范围和条件,对层析卡的贮存条件、质量标准等还需进一步研究,为商品化生产奠定基础。