基于近红外光谱技术的白酒基酒中乳酸的快速检测

郭玉姗,刘建学,2,*,李 璇,2,韩四海,2,李佩艳,2,徐宝成,2,罗登林,2

(1.河南科技大学食品与生物工程学院,河南洛阳 471023;2.河南省食品原料工程技术研究中心,河南洛阳 471023)

有机酸是白酒中重要的香味协调成分,在白酒微量成分中占据很大比例,对白酒的品质影响很大,酸类可以反应生成酯类,酯类是白酒中重要的呈香成分,因此掌握酸碱平衡是白酒勾调的关键[1]。在浓香型白酒中,乳酸是重要的呈香呈味成分,对浓香型白酒中的主体香味成分己酸乙酯有很好的助香作用,能起到缓冲调和酒味的作用,可以掩盖酒精的刺激性,还能与多种成分亲和使酒体更加协调[2-6]。检测浓香型白酒中乳酸的含量对于勾调和提高白酒品质有至关重要的作用。

目前,检测白酒中的有机酸主要采用的是气相色谱法,但气相色谱检测白酒中乳酸时直接进样会导致乳酸的结构发生变化,无法产生响应值,所以常用的方法是将白酒样品先进行酯化处理,使乳酸酯化后再进行分析,这种检测方法操作繁琐[7],而采用高效液相色谱法测定乳酸的应用较为常见,高效液相色谱法可以直接进样,避免了气相色谱分析的缺点[8]。近红外主要是对含氢化学键的化合物进行组分分析,利用物质对近红外光的吸收特性鉴定被测物的结构。近年来,近红外应用越来越广泛,相较于传统的化学分析方法和色谱法具有独特的优势,以其高效、快速、无损的优点在工业、农业、医药、化工等各个领域开展应用[9-17],如运用近红外对乙醇含量进行检测,对烟叶分级、药品快速鉴别、茶油原产地快速鉴别、牛肉营养成分的比较等方面,可以实现在线检测和现场监测,正在快速替代常规的化学分析方法。而近红外在酒类行业的应用也越来越多,常用在酒类的定量分析如对酒中的酒精度、酯类、酸类等的检测[18-21]以及定性分析方面，如建立聚类分析方法对白酒进行分类[22],针对的主要是成品酒的分析检测。对于白酒基酒中呈香成分的检测最近开始兴起[23-25],但应用近红外光谱技术对于白酒基酒中的乳酸的检测还较为少见。

本文应用高效液相色谱法测定白酒基酒样品中的乳酸含量,并通过近红外采集白酒基酒近红外透射图谱,利用偏最小二乘法建立白酒基酒中乳酸的定量分析模型,达到乳酸在线快速检测的目的。旨在为白酒生产中乳酸含量的快速检测提供一种方法,可以用于白酒的在线快速检测,还可用于白酒生产过程中的质量控制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白酒样品 选取具有代表性的浓香型白酒基酒作为试样,在生产线分段取样收集112个白酒基酒样品,某大型酒厂;乳酸标品 天津市科密欧化学试剂有限公司;无水乙醇(色谱级) 天津市光复精细化工研究所;0.45 μm微孔滤膜 上海岛津技迩商贸有限公司。

1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;Vector 33型近红外光谱仪 德国布鲁克公司,附带OPUS 6.5光谱数据采集分析软件;The Unscrambler 9.7定量分析软件 挪威CAMO公司。

1.2 乳酸含量的化学值测定

高效液相色谱条件:选取Venusil MP C18型色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温设定为40 ℃,流动相:0.1 mol/L 磷酸二氢钾缓冲液,流速:1.0 mL/min,检测波长:210 nm,运行7 min,每次进样量10 μL。

配制1、2、4、6、8、10 mg/mL浓度梯度的乳酸标准系列溶液,采用0.45 μm微孔滤膜过滤后，通过高效液相色谱进样测得标品色谱图,绘制标准曲线。白酒基酒样品进样前采用0.45 μm微孔滤膜过滤,每个样品测定两次取平均值,得到100个白酒基酒样品中乳酸含量的化学值。

1.3 近红外光谱法建立模型

1.3.1 近红外光谱采集 测定环境要求温度恒定在20～25 ℃,打开仪器预热0.5 h后，先检查信号保存峰位,然后进行参数的设置,如表1所示。以空气作为参比,将白酒基酒样品装入石英比色皿2/3左右放入样品室采集近红外光谱图。为了减小误差,试验过程中保持环境干燥和样品器皿的干燥,比色皿测完每个酒样后需要用试纸擦拭干净。每个白酒基酒样品重新装样测定3次光谱图,并取平均值作为白酒基酒最终光谱图。

近红外光谱仪器的参数设置如表1所示。

表1 近红外仪器参数Table 1 Near infrared instrument parameters

1.3.2 光谱预处理和模型的建立 应用预处理方法对近红外光谱图进行处理,能够消除客观因素(噪音、背景信息等)的干扰,提取光谱的特征信息,从而提高近红外光谱与白酒基酒中乳酸化学成分的相关性。筛选优化预处理方法,比较多种预处理方法处理后模型的效果,选取最佳预处理方法,并应用此预处理方法对近红外图谱进行处理。采用OPUS6.5分析软件的自动优化功能进行建模条件的优化,最终得出建模的最佳预处理方法、主成分数和建模谱区范围。

偏最小二乘法作为一种经典的回归分析方法,在近红外光谱定量分析检测方面应用非常广泛。它是一种多元校正分析方法,适合于分析复杂体系,能充分提取样品光谱的特征组分的有效信息,克服数据间多重相关的问题,采用偏最小二乘法建立乳酸的定量分析模型。为了提高模型的精确度,在建模的过程中需要剔除异常点。根据F检验法来识别异常点,即样品的测定值与近红外校正模型预测值的误差称为样品化学值的绝对误差,设置检测异常点的概率值为0.99,用F值表示[26]。当异常点高于所设阈值F时,系统将会以红色标记出来判定为化学值异常,根据建模情况剔除这些化学异常值。本试验采用偏最小二乘法建立乳酸含量的化学值与特征光谱的相关关系的近红外模型,通过对模型的优化得到最优模型,并对模型的预测能力和精密度进行检验。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱测定结果

2.1.1 乳酸标准曲线的建立 以乳酸标准溶液的浓度对应峰面积进行线性回归绘制标注曲线,如图1所示。结果表明，乳酸标准溶液在1～10 mg/mL浓度范围内有良好的线性关系,相关系数达到0.9998,接近于1,可以满足测定的要求。

图1 乳酸标准曲线Fig.1 The standard curve of lactic acid

2.1.2 白酒基酒高效液相色谱图 按照上文1.2中的高效液相色谱条件,将白酒基酒样品进样得到的液相色谱图,如图2所示。从图2中可以看出,白酒基酒中的组分在此液相色谱条件下得到了较好的分离,且通过标样定性确定乳酸的保留时间为5.32 min。

图2 白酒基酒高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatography of base liquor

2.1.3 乳酸的化学值测定结果 将白酒基酒样品划分为校正集样品和验证集样品,按测定的乳酸含量的大小顺序进行排序,按照“隔3选1”的方法选择校正集和验证集,最终确定校正集样品有80个,验证集样品有32个。分析这112个白酒基酒样品中校正集样品和验证集样品中乳酸含量的化学值如表2所示。

表2 白酒基酒中乳酸化学值分析Table 2 Lactic acid chemical value analysis of base liquor

由表2可知,白酒基酒中乳酸的校正集的含量范围在1.35～7.37 mg/mL,验证集的含量范围在2.12～6.35 mg/mL,校正集和验证集的乳酸含量范围较宽,样品均匀地分布在校正集和验证集,且所选建立模型的校正集样品的含量范围大于验证集样品检验的含量范围,符合建模样品的选择原则。

2.2 白酒基酒中乳酸的近红外光谱

按照上文1.3.1中的近红外操作条件,应用近红外光谱仪扫描112个白酒基酒样品采集得到的近红外光谱图如图3所示。

图3 白酒基酒近红外光谱图Fig.3 Near infrared spectrogram of base liquor

白酒基酒中含有多种呈香成分,结构较为复杂,乳酸在近红外光谱区的吸收光谱,主要是通过含氢集团伸缩振动跃迁引起的。从图3可以看出,白酒基酒样品有相似的近红外光谱图,在近红外区域出现明显的吸收峰,由于白酒中组分含量的不同,造成了吸收峰的大小和强度也不尽相同,这为白酒基酒中乳酸含量的近红外建模提供了依据。应用近红外采集白酒基酒样品近红外谱图的过程中,容易受到噪音和客观因素的干扰。从图3中可以看出,白酒基酒样品的近红外光谱图有部分重叠,在低波数范围内光谱图的曲线较为尖锐,受到了噪音的影响。为了使光谱间的差异更明显,去除无效信息,提取白酒基酒中乳酸的特征光谱,需要筛选预处理方法对谱图进行处理,处理软件采用OPUS6.5分析软件。

2.3 近红外模型的建立与优化

本试验应用OPUS 6.5分析软件的自动优化功能对建模条件进行优化,比较了常见的光谱预处理方法对谱图进行预处理,处理后得到的建模条件优化结果如表3所示。选择合适的主成分数也很重要,主成分数过低,模型的准确度会降低,不能充分表征光谱特征;主成分数过高,则模型的预测能力会下降,结果会出现过拟合的现象。根据模型的校正标准偏差(RMSECV)和决定系数(R2)来确定主成分数,当RMSECV值较低、R2值较高时对应的是最佳主成分数,此时能最大程度的反映光谱信息。

表3 建模条件优化Table 3 Optimization of conditions for establishing calibration model

分析以上建模条件优化结果,得到采用一阶导数+多元散射校正的方法预处理近红外图谱,在主成分数为3,建模区间在6102～5450 cm-1的条件下,建立的模型的RMSECV值最低为0.3064，R2为0.9225达到了最大值,因此选用此建模条件建立乳酸的定量分析模型。

分析比较偏最小二乘法中PLS1算法和PLS2算法两种建模方法建立的乳酸近红外模型的数理指标,将校正集样品中乳酸含量的测定值导入The Unscrambler 9.7软件中,与对应的近红外图谱相关联,并分别采用PLS1算法和PLS2算法建立定量分析模型。当RMSECV值较小,R2最大时说明模型的拟合度较高,所建模型的效果较好。所建PLS1模型和PLS2模型的数理指标结果如表4所示。从表4可以得出,PLS1算法建立的模型的RMSECV较小为0.31,R2较大为0.9225,所建模型的效果较好。所以本试验选用PLS1算法建立乳酸的近红外模型。

表4 PLS1模型和PLS2模型的数理指标Table 4 Mathematical indexes of PLS1 models and PLS2 models

2.4 近红外模型的检验

对模型的预测效果进行检验,剔除异常样品后,对校正集样品进行交叉检验得到校正集样品中乳酸含量的真实值和模型的预测值之间的关系如图4所示,对模型进行外部检验集检验,得到验证集样品中乳酸含量的真实值和模型的预测值之间的关系如图5所示。

图4 校正集乳酸含量的预测值与真实值相关图Fig.4 Relationship between prediction and real values of lactic acid content in calibration set

图5 验证集乳酸含量的预测值与真实值相关图Fig.5 Relationship between prediction and real values of lactic acid content in test set

从图4可以看出,校正集样品含量低的样品数量较少,样品在含量在2.5～5.5 mg/mL之间时数量较多,含量高的样品数量较少,所选校正集样品符合正态分布规律,样品均匀的分布在了回归线两侧,并且从图中可看出,含量低的样品和含量较高的样品偏差较大,含量在2.5～5.5 mg/mL之间时偏差较小;从图5可以看出，验证集样品在低含量时偏差较小,预测效果较好。乳酸校正模型的R2为0.9771,RMSECV为0.1825,验证集样品的乳酸的决定系数(R2)为0.9808,预测标准偏差(RMSEP)为0.1475。结果表明:所建模型的R2较高接近于1,模型的RMSECV和RMSEP值较小,所建模型的预测值与高效液相色谱测得的真实值相接近,模型的预测性能较好,所建模型可应用在乳酸含量的快速检测。

2.5 模型预测能力的的精密度和稳定性检验

另外取4个未参与建模的白酒基酒样品,每个白酒基酒样品通过近红外光谱仪测量10次光谱图。

通过所建乳酸定量分析模型对光谱图预测得到10次预测值,模型的精密度检验结果如表5所示。模型的相对标准偏差(RSD)均小于0.0211,模型的预测效果较好,说明所建模型的精密度和稳定性良好。

表5 模型的精密度和稳定性检验Table 5 Precision and stability test of the model

3 结论与讨论

本试验采用近红外光谱技术建立白酒基酒中乳酸的定量分析模型,通过对模型优化得到最优的建模条件,并对所建模型的预测能力和精密度稳定性进行检验。结果表明,预处理方法采用一阶导数+多元散射校正,建模区间在6102～5450 cm-1,主成分数为3的条件下建立的模型的效果最好。所建模型的校正集的R2为0.9771,RMSECV为0.1825;对模型进行验证,验证集的R2为0.9808,RMSEP为0.1475。说明所建模型的预测值和液相色谱测得的真实值相接近,模型具有很好的预测效果;且对模型的精密度和稳定性进行检验,得到模型的RSD均小于0.0211,说明模型的精密度和稳定性良好。

应用近红外光谱技术快速检测白酒基酒中的乳酸的方法,克服了传统乳酸检测方法的局限性,为白酒生产中乳酸的在线检测提供一种新的方法。该乳酸定量分析模型的建立,为白酒生产中的基酒勾调提供重要的参考依据,为白酒产品的质量控制提供了一种高精度的解决方案。后期可推广应用在白酒生产中的在线检测和质量控制,白酒生产中提高白酒的品质有着重要的科学指导意义。