款冬总黄酮提取优化及其降脂抗氧化作用研究

刘 蓓,高 超,邱 悦,沈明浩,*

(1.长春科技学院,吉林长春 130660; 2.吉林农业大学食品科学与工程学院,吉林长春 130118)

款冬,别名冬花、蜂斗菜,是菊科款冬属多年生草本植物[1],全属仅一种。我国传统上使用款冬花入药,叶柄多当做蔬菜食用,据《本草》记载,款冬润肺、泻热、止嗽,为治嗽要药[2]。目前关于款冬的研究主要集中在款冬花的化学成分及药理活性这两方面,已有研究对款冬花中的黄酮类、有机酸、萜类、生物碱、挥发油、多糖等活化学成分进行了提取、分离及鉴定,其黄酮类物质含量高达9.7%[3-6];在药理活性方面,Yun T等[7]研究报道了款冬花挥发油能改善肺纤维化大鼠肺功能及细胞外基质代谢。罗强[8]等研究表明款冬花多糖可诱导肿瘤细胞凋亡,其抗肿瘤效应可能与细胞凋亡相关基因表达的调控有关。更有关于抗炎、抗结核以及神经保护方面的报道[9]。

然而关于款冬植物本身的研究报道较少,Chanajkaczmarek J等[10]从款冬叶中提取分离并鉴定了六种黄酮醇,三种槲皮素衍生物,并且检测到三种酚酸物质。Adamczak A等[11]使用HPLC-DAD方法检测款冬叶中生物碱含量。黄酮类物质是款冬植物中一类重要的活性物质,黄酮类化合物是母核结构为2-苯基色原酮的多酚类化合物[12],多以糖苷形式存在于物质中,是一类二级代谢产物,广泛分布在各种植物中,是植物中的一种有效的活性物质。目前报道黄酮类物质在降血脂[13]、防治心脑血管疾病[14]、抗氧化[15]、抑菌抗病毒[16]等方面具有良好的作用效果。关于款冬中黄酮类物质的提取及生理功能作用无相关报道,因此本文首次对款冬总黄酮进行提取,优化提取条件,并利用SP-825大孔吸附树脂进行纯化,对纯化处理的总黄酮进行降脂及抗氧化作用研究,以期为款冬植物的开发利用提供一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿色植物款冬 吉林省临江市，晾干,粉碎,过40目筛,石油醚脱脂(液料比mL/g为5∶1),晾干备用;昆明种小白鼠(SCXK-(吉)2003-0001),吉林大学试验动物中心提供;益生牌试验动物饲料(1095) 长春市忆斯试验动物技术有限责任公司;小鼠高脂饲料[17]:基础饲料79.5%、猪油10%、蛋黄粉10%、胆盐0.5%,试验室自制;亚硝酸钠、硝酸铝、盐酸、氢氧化钠、碳酸钠、石油醚、无水乙醇、正丁醇、甲醇,以上试剂均为分析纯,北京化工;SP-825大孔吸附树脂,东鸿化工有限公司;羧甲基纤维素钠(食品级)、芦丁标准品均来自于上海析明生物科技有限公司;总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒,均购买于南京建成生物工程研究所。

AUY-220电子天平 岛津国际贸易有限公司;TY92-II型超微粉碎机 宁波新芝生物科技公司;KQ-250B型超声波清洗器 东京理化器械株式会社;层析柱 上海辰乔生物科技有限公司;恒流泵 广州沪瑞明仪器公司;RE52-ASDFGHJ98型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器公司;SP-722E型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;DK-S28型电热恒温水浴锅 上海精宏试验设备公司;WD-2102型自动酶标仪 北京市六一仪器厂;GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;水流抽气机A-1000S 日本EYELA;DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机 宁波新芝生物科技股份有限公司;超纯水系统 法国Millipore公司;U410超低温冰柜 美国NBS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 款冬总黄酮的提取 精确称量款冬粉末1.0 g,加入一定量适宜浓度的乙醇溶液,在一定温度下,超声一段时间,抽滤得滤液,减压回收乙醇至滤液剩2 mL左右为止,正丁醇水饱和溶液萃取2次,旋转蒸发至2 mL,70%乙醇定容100 mL,加入1 g活性炭进行脱色处理,过滤后,醇沉除杂,旋转蒸发至25 mL得样品液,待测。将样品液旋转蒸发,冷冻干燥处理后得款冬叶总黄酮粗提物。

1.2.2 款冬总黄酮得率的测定 配制浓度为0.10 mg/mL(溶剂是浓度为70%的乙醇溶液)的芦丁对照品标准溶液,待用。参照张国建等[18]方法测定标准曲线,制定得到吸光度A-浓度C(mg/mL)的关系方程式为:A=0.0065C+0.0243,R2=0.9993。根据绘制的芦丁标准曲线可以计算出款冬总黄酮的含量。按以下公式计算总黄酮得率:

总黄酮得率(%)=提取总黄酮质量/样品质量×100

1.2.3 单因素实验设计 单因素条件设定:乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%);料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g∶mL);提取温度(40、50、60、70、80 ℃);提取时间(10、20、30、40、50 min)。分析单因素对得率值影响。固定单因素值为乙醇体积70%、料液比1∶40 (g∶mL)、提取温度50 ℃、提取时间30 min。

1.2.4 Box-Behnken设计 通过单因素实验选出对款冬叶黄酮得率值影响较大的三个因素,利用响应面设计试验共17组。Box-Behnken试验设计因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Experimental design factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 款冬中总黄酮的纯化 按照1.2.4的最佳提取条件提取出款冬总黄酮,采用丁彩丽等[19]方法进行纯化处理。纯化条件为:选择SP825大孔吸附树脂,pH为3～4,以2 BV/h的流速进行吸附,最大上样量为44倍树脂体积,3 BV的70%乙醇溶液以1～2 BV/h流速进行洗脱。将洗脱液旋转蒸发,冷冻干燥后得纯化后款冬总黄酮粉末。按以下公式计算总黄酮纯度:

总黄酮纯度(%)=纯化黄酮质量/黄酮粗提物质量×100

1.2.6 高脂模型动物分组及造模 选取健康的昆明种小白鼠,适应环境7 d后随机分组,每组10只(雌雄各5只),共5组(空白对照组,模型对照组,黄酮高、中、低剂量组)。试验阶段空白组连续给予基础饲料,其他组连续饲喂自制的高脂饲料,饲喂高脂饲料4周左右即可建模成功。降脂试验期间各试验组给予总黄酮低、中、高剂量组(100、200、400 mg/kg),溶解各功效成分的灌胃溶剂为0.5%的羧甲基纤维素钠(食品级)。模型对照组和正常对照组灌胃溶液为0.5%的羧甲基纤维素钠。各试验组的灌胃剂量均为10 mL/kg,灌胃1 次/d,连续21 d。

1.2.7 降血脂指标的测定 试验周期结束后,各高脂饲料组小鼠禁食24 h,基础饲料组小鼠禁食12 h,摘眼球取血,将血液放在于4 ℃条件下以3500 r/min的转速离心15 min得血清(上清液)。按照试剂盒说明书测定血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量。

1.2.8 抗氧化的指标测定 试验周期结束后,高脂饲料组小鼠禁食24 h,基础饲料组小鼠禁食12 h,颈椎脱臼后立即取出肝脏,生理盐水漂洗肝脏表面血液,滤纸吸干生理盐水,以免影响组织液的浓度配比。取处理过的肝块组织,称重,按1∶9的比例添加生理盐水,使用玻璃匀浆机制备得10%的肝组织匀浆液。同理可制1%、0.25%的肝组织匀浆液,该试验操作条件为4 ℃。按照试剂盒说明书测定总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽(GSH)。

1.3 数据分析

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响 由图1知,观察折线图的变化,发现当乙醇体积分数达到70% 时,款冬总黄酮的得率值最大,当乙醇体积分数再增加是折线走势出现明显的下降趋势。黄酮类物质易溶于有机溶剂,少数溶于水。出现上述的原因可能是乙醇体积加大,溶于有机溶剂部分的黄酮类物质达到饱和,而溶于水的部分的黄酮类物质不能充分溶于溶剂中。因此确定乙醇体积分数60%～80% 作为优化范围。

图1 乙醇体积分数对得率影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on yield

2.1.2 料液比对总黄酮得率的影响 由图2知,观察折线图走势发现当料液比达到1∶40 (g∶mL)时,款冬总黄酮得率出现最大值。料液比小于1∶40 (g∶mL)时,折线图的走势是逐渐上升的,当大于1∶40 (g∶mL)时得率值出现下降。分析原因可能是加大料液比可以使原料充分与溶剂混合,有利于总黄酮的溶出,一旦达到饱和后会使得率降低。故选择料液比为1∶30～1∶50 (g∶mL)作为优化试验的范围。

图2 料液比对得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield

2.1.3 提取温度对总黄酮得率的影响 由图3可知,观察折线图可知当提取温度达到50 ℃时,款冬总黄酮得率值达到最大,之后随着温度升高,得率逐渐变小。出现此实验结果可能是乙醇挥发点较低,温度越高挥发越快,会致乙醇的浓度降低,进而影响总黄酮的得率。因此,可将提取温度在40～60 ℃作为优化试验的范围。

图3 提取温度对得率的影响Fig.3 Effect of extract temperature on yield

2.1.4 提取时间对总黄酮得率的影响 由图4可知,观察提取时间与款冬总黄酮得率值的折线走势发现,当提取时间达到30 min时,得率值达到最大,当提取时间大于30 min以后,得率值增加幅度不大。综合考虑确定时间为30 min不再进行优化。

图4 提取时间对得率的影响Fig.4 Effect of extract time on yield

2.2 款冬总黄酮响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计方案与结果 Box-Behnken试验设计及响应值见表2。

表3 Box-Behnken试验方差分析Table 3 ANOVA of Box-Behnken

图5 乙醇体积与超声温度的交互作用图Fig.5 Interaction of volume of ethanol and extract temperature hydrolysis

图6 料液比与超声温度的交互作用图Fig.6 Interaction of ratio of solid to liquid and extract temperature

2.2.3 验证试验 响应面法得到款冬总黄酮提取最佳工艺为在提取时间30 min,乙醇体积分数80%,料液比41∶1 (mL∶g),超声温度58 ℃。按此工艺重复三次平行实验,款冬总黄酮得率为7.18%,与响应面拟合理论值相等,因此实验结果可靠,提取工艺稳定可行。

2.3 款冬总黄酮纯化结果

按照最优条件提取款冬总黄酮,测定款冬总黄酮的纯度为29.8%。将该条件下提取的款冬总黄酮进行纯化处理,纯化条件参照1.2.5。纯化后款冬中总黄酮的纯度为63.2%,与纯化处理前相比款冬总黄酮的纯度升高了2.12倍,大大提高了款冬总黄酮的含量。说明SP-825大孔吸附树脂具有较强的吸附作用,可以进一步起到分离纯化效果,提高纯化物纯度。

2.4 款冬总黄酮对降血脂作用的影响

近年来世界上高血脂症人群增加,高血脂症已成为危害人类的健康疾病之一[20]。高血脂症是指血液内胆固醇和甘油三酯及相关脂蛋白的升高(也包括高密度脂蛋白的降低),目前报道中药和相关制剂对于高血脂症具有治疗保健预防的功能[21]。天然植物存在功效成分如黄酮、皂苷、多糖等，在降脂方面表现出良好的作用效果。

2.4.1 款冬总黄酮对小鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)的影响 由表4可知,模型组的TG、TC含量都高于空白对照组且组间组间差异性极显著(p<0.01),说明高血脂模型小鼠建模成功。与模型组相比,款冬总黄酮高、中、剂量组的TG含量均差异性显著(p<0.05)或极显著(p<0.01),说明款冬总黄酮可以有效调节TG水平;与模型对照组相比,款冬总黄酮各剂量组的TC水平均差异性极显著(p<0.01),说明各剂量组在TC水平上作用效果明显。说明款冬总黄酮各剂量组可以有效调节模型小鼠的TC和TG水平,降脂作用效果显著,且降脂效果剂量呈正相关。

表4 款冬总黄酮对小鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)的影响Table 4 Effect of Tussilago farfara L. total flavonoids on the contents of TG、TC in serum of

2.4.2 款冬总黄酮对小鼠血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的影响 由表5可知,与空白对照组相比,模型对照组的HDL-C和LDL-C均差异性极显著(p<0.01),说明模型可用。在HDL-C水平上,同模型组相比款冬叶总黄酮各剂量均差异性极显著(p<0.01)，可以有效调节 HDL-C这一指标。在LDL-C水平上,款冬总黄酮各剂量组均不同程度低于模型对照组且组间差异性显著(p<0.05)或极显著(p<0.01),可以有效降低模型小鼠LDL-C含量。说明款冬总黄酮各剂量组可以有效调节模型小鼠的LDL-C和HDL-C水平,降脂作用效果显著,且降脂效果与剂量呈正相关。

表5 款冬总黄酮对小鼠血清中HDL-C和LDL-C的影响Table 5 Effect of Tussilago farfara L. total flavonoids on the contents of HDL-C、LDL-C in serum of

2.5 款冬总黄酮对抗氧化作用的影响

机体中的超氧化物歧化酶SOD是清除机体中氧自由基的一类重要酶;MDA是由超氧自由基攻击多价不饱和脂肪酸而生成的脂质氧化物,代表机体的损伤程度;谷胱甘肽(GSH)可将机体内有害物质转化为无害物质并排泄出体外[22-24]。因此,将T-SOD、MDA及GSH的含量作为抗氧化的指标。由表6可知,同空白对照组相比,模型组小鼠肝组织中的 T-SOD和GSH含量降低,MDA含量显著升高,且组间差异性极显著(p<0.01),说明模型小鼠可用。与模型组相比,款冬总黄酮高、中、低剂量组均可显著增加模型小鼠血清中T-SOD和GSH含量,降低MDA含量,差异性上均为极显著(p<0.01)。说明款冬总黄酮具有一定抗氧化作用。综合各组数据分析最佳剂量组为款冬总黄酮高剂量组。

表6 款冬总黄酮对小鼠肝组织总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的影响Table 6 Effect of coltsfoot total flavonoids on the contents of T-SOD、MDA、GSH in liver tissue of

3 结论

对款冬中有效成分黄酮采用超声波辅助提取法优化的试验中,以得率值作为评定指标,提取时间30 min,乙醇体积分数80%,料液比1∶41 (g∶mL),超声温度58 ℃,在相同件下做三次验证试验得得率平均值为7.18%,试验模型可用,提取工艺稳定可行。经SP-825大孔吸附树脂纯化提高了款冬总黄酮纯度,为63.2%。

降脂试验以高脂饲料诱导构高脂模型小鼠,测定试验组的指标(TC、TG、LDL-C、HDL-C),结果说明款冬总黄酮各剂量组指标与模型组相比均差异性显著。降脂作用效果与剂量呈正相关,款冬总黄酮具有良好的降脂效果。

抗氧化试验,款冬总黄酮高、中、低剂量组均可升高SOD和GSH的含量,并能降低有害物质MDA的含量,说明款冬总黄酮具有一定抗氧化作用。综合各组数据分析最佳剂量组为款冬总黄酮高剂量组。