响应面法优化微波辅助果胶酶制备壳寡糖的工艺
2018-10-24李丹丹张立斌
李丹丹,马 英,柏 韵,张立斌,张 肖,张 振,2,*
(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001; 2.沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110868)
壳寡糖是由甲壳素脱乙酰基后的产物壳聚糖经过降解而得的聚合度为2～10的低分子聚合物。具有水溶性[1-2]、提高机体免疫力、抗感染、抗菌作用、抗癌,抗肿瘤等功效[3-4]。壳寡糖在目前的制备方法主要有化学降解法、酶解法、物理法等[5]。化学降解法主要是采用合适化学方法对壳聚糖进行有限降解而得到壳寡糖[6]。该法操作简单,但降解产物质量分布宽,分离纯化降解产物有一定难度,消耗试剂大和后处理较复杂[6]。如刘琳等[7]从过氧化氢制备聚合度为6～8的壳寡糖的研究工艺中发现产物得率提高,达到62.17%,且平均聚合度为6.87。郑必胜等[8]发现壳聚糖在过氧化氢降解的工艺中,最优条件下完全降解且平均相对分子质量在2000以下,结构单元聚合度在10以下。物理法不易引入杂质、易于控制、污染小,但产物分子量分布宽、得率低。丁盈红等[9]利用微波辐射快速制备水溶性壳聚糖,设计了正交试验法,得到最优化反应条件,显示320 W时辐射4 min和560 W时辐射2 min制备水溶性壳聚糖效果亦相当不错。与前几种相比,酶解法具有无污染、产物得率高、产品均一性好等优点,因此,酶解法降解壳聚糖是近年研究的重点之一。
本实验将物理法与酶法相结合,采用微波辅助酶法制备壳寡糖,并利用响应面得到最佳工艺条件,以期为壳寡糖的制备提供一种新型有效的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
壳聚糖脱乙酰度80%～95% 生化试剂国药集团化学试剂有限公司;果胶酶3000 U/mL生物试剂山东枣庄杰诺生物酶有限公司;无水亚硫酸钠 天津虔诚伟业科技发展有限公司;无水乙酸钠、酒石酸钾钠、氢氧化钠、冰乙酸 天津市风船化学试剂科技有限公司;3,5-二硝基水杨酸 天津市大茂化学试剂厂;葡萄糖 天津市津北精细化工有限公司;苯酚 沈阳市新化试剂厂;其他试剂 均为分析纯。
722s可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;电磁炉 九阳股份有限公司;M1-203A型微波炉 广东美的厨房电器制造有限公司;DU-65D高精度水浴槽、恒温水浴锅、电子天平 上海精密科学仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 酶活力的测定 果胶酶水解果胶生成的半乳糖醛酸具有还原性糖醛基,可用次亚碘酸法定量测定,以此表示果胶酶的活性[10]。1 mL酶液在50 ℃,pH为3.5的条件下,1 h分解果胶产生1 mg半乳糖醛酸定义为一个酶活单位。实验所用果胶酶酶活为3000 U/mL。
1.2.2 壳寡糖的制备 准确称取0.1 g壳聚糖,溶解于一定体积0.2 mol/L不同pH的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中,配制成浓度2%(w/v)的胶体溶液,加入一定量的果胶酶,分别在不同微波功率、不同反应温度下反应1 h,随后煮沸10 min灭酶活,过滤。
1.2.3 单因素实验
1.2.3.1 微波功率对微波辅助酶法制备壳寡糖的影响 在反应温度为50 ℃、酶用量2000 U/g、pH为4.4、辐射时间2 min条件下,考察微波功率分别为100、300、500、700、900 W时样品中还原糖含量。
1.2.3.2 反应温度对微波辅助酶法制备壳寡糖的影响 在微波功率500 W、酶用量2000 U/g、pH为4.4、辐射时间2 min条件下,考察反应温度分别为40、45、50、55、60 ℃时样品中还原糖含量。
1.2.3.3 pH对微波辅助酶法制备壳寡糖的影响 在反应温度为50 ℃、微波功率为500 W、加酶量2000 U/g、辐射时间2 min条件下,考察pH为3.6、4.0、4.4、4.8、5.2时样品中还原糖含量。
1.2.3.4 加酶量对微波辅助酶法制备壳寡糖的影响 在反应温度为50 ℃、微波功率为500 W、pH为4.4、辐射时间2 min条件下,考察加酶量分别为800、1200、1600、2000、2400 U/g时样品中还原糖含量。
1.2.4 响应面实验 为优化微波辅助酶法制备壳聚糖工艺,在单因素实验的基础上,选择加酶量、pH、微波功率为自变量,还原糖浓度为Y值,运用响应面法设计试验,分析各自变量及其交互作用对还原糖浓度的影响。
表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Response surface experiment factor level design
1.2.5 还原糖含量的测定 用DNS法[11]拟合得标准曲线方程y=0.9422x(R2=0.9941),说明方程拟合度较好[12]。利用比色法测定样品中的含糖量[13-14]。先取样品液适当稀释,使糖浓度为0.1～1.0 mg/mL,再量取稀释后的糖液1 mL于15 mL试管中,准确加入2 mL DNS试剂,置于沸水浴中煮沸2 min,以流水迅速冷却,用水定容至15 mL试管中,摇匀。在459 nm处测定吸光度,与标准葡萄糖曲线作对照,即可计算出样品中还原糖含量(mg/mL)。
1.2.6 所得壳寡糖平均分子量测定 采用端基分析法表征壳聚糖降解程度[15-17]。壳聚糖三次完全降解测定的平均值A0。每次实验中壳聚糖降解之后检测得的还原端基数值为A1,壳聚糖的平均聚合度估算公式为:DP=A0/A1,并按下式计算平均分子量:Mn=179DP-18(DP-1)
1.2.7 微波辅助酶法制备壳寡糖工艺与常规酶解方法的比较 在加酶量2100 U/g,微波功率510 W,pH4.4,反应温度50 ℃条件下分别采用微波辅助酶法,微波降解法和常规酶法进行制备壳寡糖效果比较,验证微波辅助酶法制备壳寡糖工艺的优点。
1.3 数据处理
利用SPSS 19.0软件进行试验数据分析,采用Excel进行绘图,利用SPSS 19.0软件进行试验数据分析，结果以平均值±标准差表示,利用t-检验进行组间分析,当p<0.01为差异极显著,0.01
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 微波功率对壳聚糖酶解效果的影响 由图1可知,随着微波功率的增大,还原糖含量先增加后减少,说明微波对果胶酶的酶活在一定的范围内具有促进作用。当微波功率设定为500 W时,还原糖含量最高,因此,选定微波功率为500 W。
图1 微波功率对壳寡糖制备的影响Fig.1 Effect of microwave power on reducing sugar content
2.1.2 反应温度对壳聚糖酶解效果的影响 酶对温度具有极高敏感性,反应温度对酶反应速率有很大影响。当反应体系中其他条件不变,仅反应温度改变时,果胶酶在不同反应温度下水解壳聚糖的效果如图2所示。从图中可知,还原糖含量随着温度的上升呈现先上升后下降的趋势,在40～50 ℃范围内,随着温度的升高,还原糖含量逐渐上升,50 ℃时还原糖含量最高,当超过55 ℃,还原糖含量开始下降。说明温度在50 ℃左右的范围内,可以达到较好的酶解效果。可能的原因是随着温度的升高,反应物的能量增加,分子间碰撞的频率也增加,从而提高酶解速率,但是当温度过高,超过了酶的最适温度时,酶活性将降低,导致水解速度下降。
图2 反应温度对壳寡糖制备的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on reducing sugar content
2.1.3 反应体系pH对壳聚糖酶解效果的影响 当反应体系中其他反应条件不变,仅反应pH改变时,果胶酶在不同pH条件下水解壳聚糖的效果变化图如图3所示,从图中可知反应体系pH对酶解效果有显著影响。产物中还原糖含量随着pH的上升呈现先上升后下降的趋势。当pH处于3.6～4.4范围内,随着pH升高,还原糖含量逐渐上升,当pH超过4.4之后,还原糖含量开始下降,因此,最佳pH为4.4。
图3 pH对壳寡糖制备的影响Fig.3 Effect of pH on reducing sugar content
2.1.4 加酶量对壳聚糖酶解效果的影响 从图4中可以看出,加酶量从800 U/g上升至2000 U/g时,还原糖含量缓慢上升,当加酶量大于2000 U/g时,还原糖含量小幅下降,说明加酶量对壳聚糖的酶解效果有一定的影响。在加酶量达到酶解饱和浓度之前,壳聚糖的酶解效果随着果胶酶用量而增强,但当加酶量达到饱和后,酶解反应趋于稳定,增大加酶量亦难提高还原糖含量,因此,果胶酶最佳用量为2000 U/g。
图4 酶用量对还原糖含量的影响Fig.4 Effect of enzyme dosage on reducing sugar content
2.2 响应面实验
根据预实验和文献,影响反应结果的因素按作用效果排序依次为pH>酶用量>微波功率>反应温度[18],因此选择加酶量、pH、微波功率,3个因素进行响应面分析。利用Design-Expert 8.0.6进行响应面设计,以还原糖含量(Y)为响应值,响应面试验结果如表2,对表2进行回归分析,得到回归方程:Y=1.96+0.041A+0.022B+0.025C-0.043AB+0.042AC+0.026 BC-0.08A2-0.12B2-0.13C2
表2 Box-Behnken试验设计结果Table 2 Results of the Box-Behnken test
2.3 响应面分析与优化
表3 Box-Behnken回归方程方差分析Table 3 Box-Behnken regression analysis of variance
由图5可知,加酶量、pH、微波功率三个因素之间存在交互作用。图5(a)为加酶量和pH之间相互作用的效果,可知:还原糖含量随着加酶量和pH的增加先增加后降低,有明显的最大值。增加加酶量可以提高壳聚糖的酶解率,反应越完全,pH的变化则影响果胶酶的活性。图5(b)为微波功率和加酶量之间作用的影响,微波功率较低时,蛋白质浓度随着加酶量的增加而增加,提高微波功率,分子间运动加快,当功率过高时,果胶酶的活性受到影响,还原糖含量减少。图5(c)为微波功率和pH之间相互作用的效果,随着两者的增加,还原糖含量同样呈现先增加后减少的趋势,曲面明显,有明显的峰值,两者之间存在相互作用。
图5 三种因素相互作用响应曲线面Fig.5 Response surface of three-factor interaction
2.3.1 微波辅助酶法制备壳寡糖的最佳工艺条件确定 通过软件Design-ExpertV8.0.6求解方程,得到微波辅助酶法制备壳寡糖最佳提取工艺条件为:加酶量2096.93 U/g、pH4.42、微波功率512.12 W、在上述条件下由响应面模型预测的还原糖含量为1.9688 mg/mL。为了检测模型可行性,结合具体自身实际情况,在加酶量2100 U/g、pH4.4、微波功率510 W、反应温度50 ℃条件下,经过三次重复试验,得到样品中还原糖含量平均值为1.964±0.011 mg/mL,与预测值结果相近(RSD=0.0065),模型可靠。
2.3.2 壳寡糖平均分子量 采用端基分析法表征壳聚糖降解程度,A0=3.38 mmol/g,A1=0.658 mmol/g,平均聚合DP=5.14,壳寡糖平均分子量Mn=845.54。舒德海[19]利用氧化法预处理酶法制备的壳寡糖平均分力量为Mn=917.68,刘琳[7]用过氧化氢法制备的特定聚合度壳寡糖平均分子量为Mn=907.15,本实验所得壳聚糖平均分子量稍低。
2.3.3 不同方法制备壳寡糖产率的比较 每种方法制备均做3次平行试验取平均值,对不同方法制备甲壳低聚糖的效果进行比较,结果如表4所示。
由表4可知,微波辅助果胶酶制备壳寡糖,与单一果胶酶酶解法(1.747 mg/mL)相比提高了12%,与单一微波法(1.671 mg/mL)相比提高了18%,同时采用微波辅助酶法降解壳聚糖,能够大大节省单纯酶解时间,因此有着明显的成本优势。
表4 不同制备方法还原糖含量的比较Table 4 Comparison of reducing sugar content of different preparation methods
3 结论
通过单因素实验研究了果胶酶酶用量,酶解温度,反应体系pH,微波功率对壳寡糖产率的影响,并采用了正交试验设计法优化了最佳工艺,所得最佳制备条件为:果胶酶加酶量为2100 U/g,酶解温度为50 ℃,反应体系pH为4.4,微波功率510 W辐射2 min。此条件下微波辅助酶法制备壳寡糖所得壳寡糖的得率均高于单一酶法制备和单一物理法制备。因此,相比单一制备壳寡糖的方法,本实验采用物理法与酶法相结合的方法对壳寡糖制备工艺进行优化,为获得最佳的壳寡糖制备工艺及其工业生产提供理论依据,并验证了其优点:微波辅助果胶酶制备壳寡糖,与单纯微波法和酶法降解相比,有较高的产率,同时采用微波辅助酶法降解壳聚糖,能够大大节省单纯酶解时间,因此有着明显的成本优势。
