离子液体结合微波提取石上柏中穗花杉双黄酮工艺优化

王 刚,黎 丹,蒋奉秦,曾娣菊,谢显语,何宇岐

(遵义医学院药学院,贵州遵义 563000)

石上柏(SelaginelladoederleiniiL.)属于蕨类卷柏科卷柏属植物,多年生草本,也叫深绿卷柏,多分布在我国贵州、四川、重庆、广西等地。本药材甘、涩,性温平,是一种药食两用植物,传统中医理论认为其具有清热解毒、活血化瘀、祛风除湿等功效[1-4]。可用于临床上治疗鼻咽癌、绒毛膜上皮癌、消化道癌、宫颈癌、肺癌、肝癌[5-7]等肿瘤病;同时对多种感染性炎症,特别对急性扁桃腺炎、肺炎等效果显著[8]。

穗花杉双黄酮是石上柏的主要指标性成分[9],具有较强的抗氧化、降血脂、抗菌及抗肿瘤等作用[10-11]。传统提取穗花杉双黄酮方法主要采用乙醇回流提取法,存在耗时长、效率低、温度较高等问题。根据穗花杉双黄酮的理化性质,选择一种高选择性、专一性的提取方法是很有必要的。

离子液体是一种环保的“绿色溶剂”和“可设计性溶剂”,可通过改变离子液体阴、阳离子的结构,调整离子液体的溶解性、pH、疏水性等性能参数,本文对以N-甲基咪唑类离子液体(IL)为提取溶剂,采用微波提取法(MAE)提取石上柏中穗花杉双黄酮,并结合单因素和正交实验优化提取工艺参数,旨在为中药石上柏的综合开发和利用提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

石上柏 采自贵州赤水,经贵州遵义医学院药学院天然药物研究所杨建文教授鉴定为真品;穗花杉双黄酮标准品 纯度>98%,成都瑞芬恩生物有限公司(生产批号:160622);乙酸乙酯、无水乙醇 分析纯,成都科龙试剂公司;溴化1-丁基-3-甲基咪唑([C4mim]Br)、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C6mim][PF6])、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐([C4mim][OAc])、1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C8mim][PF6])、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([C4mim][BF4])、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([C4mim][PF6]) 上海成捷化学有限公司。

1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司;Waters C18 Symmetry®色谱柱 美国Waters公司;SECURA124-1CN型电子分析天平 德国赛多利斯公司;RE-52型旋转蒸发仪 上海亚荣仪器公司;Xinyi-1A型微波提取仪 杭州艾普仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石上柏穗花杉双黄酮的提取

1.2.1.1 离子液体微波提取 取干燥好的石上柏药材(含水率为5%)10 g粉碎至40目,置250 mL圆底烧瓶中,加入一定体积的95%乙醇和离子液体(根据文献[12]选择在一系列醇中溶解度最好的乙醇溶解离子液体),设置一定微波功率,在一定的时间和温度下进行微波提取,提取完后减压抽滤,将滤液减压浓缩,转移到100 mL容量瓶中,用95%乙醇定容作为穗花杉双黄酮溶液。通过液相分析,测定穗花杉双黄酮的峰面积,利用线性回归方程计算穗花杉双黄酮的含量,从而得到石上柏中穗花杉双黄酮的得率。

1.2.1.2 乙醇回流提取法 取10.0 g(40目)石上柏于烧瓶中,加120 mL 95%乙醇(固液比1∶12 (g/mL)),置于80 ℃恒温水浴锅,提取2 h,减压抽滤,取滤液于1000 mL容量瓶中,加95%乙醇定容至刻度。平行实验3次[4]。

1.2.1.3 乙醇微波提取法 取10.0 g(40目)石上柏用滤纸包裹放入微波提取器内,于烧瓶中加150 mL 95%乙醇,加热功率400 W,提取时间40 min,提取温度为47 ℃。将提取液倒入1000 mL容量瓶中,加95%乙醇定容至刻度。平行实验3次[13]。

1.2.2 离子液体的筛选 分别考察[BF4]-、[PF6]-、Br-和[OAC]-对穗花杉双黄酮得率的影响,均与阳离子[C4mim]+结合,采用微波辅助提取,提取功率500 W,固液比1∶10,提取温度50 ℃,加热时间30 min,提取1次,减压抽滤,滤液减压浓缩,测定石上柏提取物中穗花衫双黄酮得率。

分别考察[C6mim]+、[C8mim]+、[C4mim]+对穗花杉双黄酮得率的影响,均与阴离子[PF6]-结合,采用微波辅助提取,提取功率500 W,固液比1∶10,提取温度50 ℃,加热时间30 min,提取1次,过滤,滤液减压浓缩,测定穗花衫双黄酮得率。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 离子液体浓度对石上柏穗花杉双黄酮得率的影响 分别考察离子液体浓度1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L,采用微波辅助提取,提取功率500 W,固液比1∶10,提取温度50 ℃,加热时间30 min,提取1次,过滤,滤液减压浓缩,测定穗花衫双黄酮得率。

1.2.3.2 微波功率对石上柏穗花衫双黄酮得率的影响 考察微波功率分别为100、300、500、700、900 W条件,按固液比1∶10加入2 mmol/L离子液体溶液,提取功率为500 W,时间30 min,提取温度50 ℃,提取1次,过滤,滤液减压浓缩,测定穗花衫双黄酮得率。

1.2.3.3 固液比对石上柏穗花杉双黄酮得率的影响 各药材按固液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g/mL)的比例加入2 mmol/L离子液体溶液,采用微波辅助提取,温度为50 ℃,提取功率为500 W,时间30 min,提取1次,过滤,滤液减压浓缩,测定穗花衫双黄酮得率。

1.2.3.4 提取时间对石上柏穗花杉双黄酮得率的影响 分别考察提取时间为10、20、30、40、50、60 min对石上柏穗花衫双黄酮得率的影响。按固液比1:10加入2 mmol/L离子液体溶液,提取功率为500 W,温度50 ℃,提取1次,过滤,滤液减压浓缩,测定穗花衫双黄酮得率。

1.2.3.5 加热温度对石上柏穗花杉双黄酮得率的影响 分别考察温度30、40、50、60、70 ℃对石上柏穗花衫双黄酮得率的影响。按固液比1∶10加入2 mmol/L离子液体溶液,提取功率为500 W,时间30 min,按上述温度提取,提取1次,过滤,滤液减压浓缩,测定穗花衫双黄酮得率。

1.2.4 正交试验 以提取温度、微波功率、提取时间为自变量,以石上柏提取物中穗花杉双黄酮得率为考察指标,采用SPSS 19.0软件来对数据进行处理分析,选择出最佳提取工艺。试验因素和水平设计见表1。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor and level table

1.2.5 穗花杉双黄酮得率的测定

1.2.5.1 色谱条件 对石上柏提取物进行紫外全波长扫描,综合最大吸收情况,试验结果显示,检测波长为330 nm时的色谱峰灵敏度高,峰面积较好,所以确定330 nm为检测波长。

色谱柱:Dikma Diamons C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈-0.1%甲酸水,采用梯度洗脱程序(表2);检测波长:330 nm;柱温:25 ℃;流速:0.6 mL/min;进样量:10 μL;进样前样品用0.45 m微孔滤膜过滤。

表2 高效液相梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program of HPLC

在上述条件下,穗花杉双黄酮与其它色谱峰达到了基线分离,如图1A所示。此外,石上柏提取液在相同色谱操作条件下的结果见图1B。

1.2.5.2 标准曲线的制作 精密称取穗花杉双黄酮标准品19.5 mg,加甲醇适量置25 mL容量瓶中,超声溶解,室温静置,并用甲醇稀释至刻度,摇匀,制成0.780 mg/mL的穗花杉双黄酮标准品溶液。精密吸取穗花杉双黄酮标准品溶液1、2、3、4、5、6 mL,分别置于10 mL 容量瓶中,加甲醇定容,摇匀,得系列标准品溶液,分别注入高效液相色谱仪中,测定峰面积。以标准品峰面积为纵座标,浓度为横座标,绘制标准曲线,得到穗花杉双黄酮回归方程为:Y=5293X-2881.8,相关系数r=0.9995。结果表明穗花杉双黄酮的浓度在78.0～468.0 μg/mL范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

1.2.5.3 石上柏穗花杉双黄酮得率的计算 穗花杉双黄酮得率(%)=m1/m×100,式中,m为石上柏药材总质量(g);m1为石上柏中穗花杉双黄酮的质量(g)。

1.2.6 与传统提取方法的比较研究 以穗花杉双黄酮得率为考察指标,将离子液体微波辅助提取法与传统两种提取方法进行了对比。分别称取石上柏药材10.0 g,3种提取方法作重复实验3次,取平均值作对比。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 离子液体的筛选

样品的高效液相色谱图结果如图1所示,在石上柏提取物高效液相色谱图中穗花杉双黄酮与其他杂峰达到了基线分离。不同离子液体对穗花杉双黄酮得率的影响结果如图2A所示,得到不同阴离子离子液体对穗花杉双黄酮的得率为[C4mim][PF6]>[C4mim][BF4]>[C4mim][OAC]>[C4mim]Br。因此选择最优的阴离子为[PF6]-。结果如图2B所示,得到不同阳离子离子液体对穗花杉双黄酮的得率为[C6mim][PF6]>[C8mim][PF6]>[C4mim][PF6]。因此选择最优阳离子为[C6mim]+。综上所述,最佳离子液体组合为[C6mim][PF6]。

图1 样品的高效液相色谱图Fig.1 HPLC spectra of samples注:A：穗花杉双黄酮标准品;B：石上柏离子液体提取物;1-穗花杉双黄酮。

图2 不同离子液体对穗花杉双黄酮得率的影响Fig.2 Effect of the different ionic liquid on the yields of amentoflavone注:A：阴离子;B：阳离子。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 离子液体浓度对穗花杉双黄酮得率的影响 由图3可以看出,随着离子液体浓度的增加,穗花杉双黄酮得率也随着增加。但离子液体浓度在2.0～3.0 mmol/L范围内,穗花杉双黄酮得率基本无明显变化。可能是穗花杉双黄酮在离子液体相中的溶解己达饱和,考虑实验经济及环保方面的因素,选择2.0 mmol/L作为离子液体最佳浓度。

图3 离子液体浓度对穗花杉双黄酮得率的影响Fig.3 Effect of the different concentration of ionic liquid anions on the extraction efficiency of amentoflavone

2.2.2 微波功率对穗花杉双黄酮得率的影响 从图4可以看出,开始随着微波功率的增加,穗花杉双黄酮得率随之增加。当微波功率超过500 W时,穗花杉双黄酮得率反而下降,推断可能是当微波功率过高时,温度不易控制,同时反应体系温度开始上升,因而产率下降。由于微波功率的影响明显,需进一步通过正交试验分析,选择在300～700 W的范围内进行优化。

图4 微波功率对穗花杉双黄酮得率的影响Fig.4 Effect of microwave power on the extraction yield of amentoflavone

2.2.3 固液比对穗花杉双黄酮得率的影响 从图5可以看出,随着固液比例的增大,产品得率随之增加,当固液比在1∶15～1∶30 (g/mL)时,得率基本没有明显变化。这可能是由于固液比太低时,溶剂没有充分浸润、渗透到药材中,因而产品得率不高。考虑到固液比的增加会造成后处理的困难以及溶剂的浪费。因此,固液比选择1∶15。

图5 固液比对穗花杉双黄酮得率的影响Fig.5 Effect of solid/liquid ratio on the extraction yield of amentoflavone

2.2.4 提取时间对穗花杉双黄酮得率的影响 由图6可以看出,提取时间从10 min增至40 min时,穗花杉双黄酮得率逐渐增加,但在40 min之后,得率逐渐减少,可能是加热时间过久,穗花杉双黄酮发生变化,因而得率减少。由于提取得率对提取时间有明显影响,需进一步通过正交试验分析,选择在30～50 min的范围内进行优化。

图6 提取时间对穗花杉双黄酮得率的影响Fig.6 Effect of extraction time on the extraction yield of amentoflavone

2.2.5 提取温度对穗花杉双黄酮得率的影响 由图7可以看出,开始随着温度的增加,穗花杉双黄酮得率逐渐增加,但超过50 ℃后,得率有所减少,原因可能是,穗花杉双黄酮含有多个酚羟基,温度太高,易使产品发生氧化。由于提取温度的影响明显,需进一步通过正交试验分析,选择在40～60 ℃的范围内进行优化。

图7 提取温度对穗花杉双黄酮得率的影响Fig.7 Effect of extraction temperature on the extraction yield of amentoflavone

2.3 正交试验结果

由表3和表4可知,各因素对穗花杉双黄酮得率的影响大小顺序为提取时间>微波功率>提取温度,其中前两者对穗花杉双黄酮的提取工艺均有显著影响(p<0.05)。最终确定最优提取工艺为A2B2C2,即微波功率为500 W、提取温度为50 ℃、微波提取时间为40 min。

表3 正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal experimental design and result

表4 方差分析表Table 4 ANOVA table

2.4 验证试验

按照上述最优工艺进行提取,重复实验3次,测定穗花杉双黄酮得率。结果,3次实验中石上柏穗花杉双黄酮得率分别为0.61%、0.60%、0.62%,平均得率为0.61%(RSD=1.64%,n=3)。

2.5 与两种传统提取方法的比较分析

如表5所示,与乙醇回流提取法对比,离子液体微波辅助提取法可显著提高穗花杉双黄酮的得率(p<0.05),且显著地缩短了提取时间(p<0.05)。同时,在相同的提取时间(40 min)内,离子液体微波辅助提取法的相对得率显著高于微波辅助提取法。综上所述,离子液体微波辅助提取法相比于两种提取方法具有相当的潜力,是一种快速、高效、绿色的提取穗花衫双黄酮的方法。

表5 3种提取方法对提取效果的影响(n=3)Table 5 Effect of three extraction methods on the extraction yield of amentoflavone

3 结论

本实验针对离子液体作为“绿色溶剂”具有可设计性的特点,首次采用离子液体作为溶剂,并结合微波辅助提取石上柏中穗花杉双黄酮。通过单因素实验和正交设计考察,得到最优提取工艺:固液比为1∶15 (g/mL),微波功率500 W,提取时间为40 min,提取温度为50 ℃,离子液体浓度为2.0 mmol/L,穗花杉双黄酮得率0.61%±0.08%。将其与两种传统提取方法进行比较(乙醇微波辅助提取和乙醇回流提取)研究发现,离子液体结合微波辅助提取方法,在穗花杉双黄酮得率和提取时间均优于乙醇微波辅助提取和乙醇回流提取,提取效果理想。

结果证明,离子液体微波辅助提取法不仅增加了提取效率,还显著地缩短了提取时间(p<0.05)是一种快速、高效、绿色的提取穗花杉双黄酮的方法,可为石上柏穗花杉双黄酮的提取工艺提供理论基础。