小儿急性淋巴细胞白血病亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性及甲氨蝶呤血药浓度监测的意义

陈丽萍，吴云波，刘 静

急性淋巴细胞白血病 （acute lymphoblastic leukemia，ALL）在儿童白血病中最为常见，而甲氨蝶 呤 （Methotrexate，MTX） 用 于 临 床 治 疗 儿 童ALL，是缓解后治疗的关键药物之一。目前的研究证实，全身应用常规剂量的MTX不易透过血脑、血睾屏障，脑脊液中MTX的浓度很低。而增加MTX的剂量可以明显提高血液和脑脊液的药物浓度［1］。但随之会带来一些不良反应，包括口腔溃疡、胃肠道黏膜损害、白细胞不同程度下降及肝肾功能不全等。笔者对41例ALL患者大剂量甲氨蝶呤（highdose methotrexate，HDMTX）化疗时亚甲基四氢叶酸还 原 酶 （methylene tetrahy drofolate reductase，MTHFR）基因多态性以及血药浓度监测数据进行统计分析，并观察其在应用HDMTX后的不良反应，为MTX个体化用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月—2016年1月某院血液科收治的ALL小儿患者41例，男26例，女15例；年龄1～12岁，平均6.3岁。其中41例患者经骨髓细胞形态学与免疫组化检验并符合临床急性淋巴细胞白血病诊断标准，且处于缓解期。

1.2 研究方法

1.2.1 甲氨蝶呤治疗方法 41例患者均予以VDLP方案诱导缓解治疗，以CAM方案［环磷酰胺（CTX）、阿糖胞苷（Ara－C）、6－巯基嘌呤（6－MP）］巩固治疗，达到完全缓解后，经检测血象指标达到：粒细胞＞1.5×109/L，白细胞≥3×109/L，血红蛋白＞90 g/L，血小板＞100×109/L，同时肝肾功能指标均正常。此时开始采用大剂量 MTX＋亚叶酸钙 （calciumfoli－nate，CF）方案进行髓外白血病的预防性治疗基因型为CC的ALL患者，使用MTX 3 g/m2；基因型为CT和TT的ALL患者，增加四氢叶酸钙解救次数。其治疗方案如下：（1）给予缓解期每疗程MTX总量的1/6（每次不超过500 mg）作为突击量，30 min内快速静脉滴入；余 5/6量，于23.5 h内匀速持续静脉滴入。（2）停止滴注MTX 12 h后用亚叶酸钙解救，15 mg/m2·次，6 h/次，共 6～8次。 （3）患者化疗期间合并用药：给予磷酸肌酸钠保护心肌功能；多烯磷脂酰胆碱促进受损的肝功能和酶活力恢复正常，调节肝脏的能量平衡，促进肝组织再生；盐酸托烷司琼阻断呕吐反射过程中神经介质的化学传递，治疗对化疗及放疗引起的呕吐。

1.2.2 甲氨蝶呤基因检测 开始采用大剂量MTX冲击治疗前抽取患者静脉血2 ml，EDTA抗凝，使用基因组DNA抽提试剂盒 （北京天根公司）提取DNA。 MTHFR（677C＞T）多态位点采用凯杰公司的焦磷酸检测技术进行检测。使用北京博迈德公司的PCR试剂配扩增反应液，引物由凯杰公司提供的软件进行设计，再由上海生工合成。PCR条件：95℃3 min，（95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）×45 个循环。PCR完成后用焦磷酸测序仪（PyroMark Q96 ID）进行测序分型。

1.2.3 甲氨蝶呤血药浓度监测 大剂量MTX开始滴注后48 h、72 h采对侧上肢静脉血2 ml，应用TDX荧光偏振免疫分析仪（FPIA，美国雅培公司）检测MTX血药浓度。MTX试剂由雅培公司提供。直至血药浓度达0.1μmol/L以下时停止监测和解救。

1.2.4 观察指标 观察所有患者不同基因多态性以及MTX血药浓度水平，其发生不良反应包括骨髓抑制、肝肾损害、皮肤损害、恶心呕吐等的比例，比较其差异。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0软件包进行统计分析，MTHFR基因型与不良反应关系的分析采用频数分布，组间比较采用 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者接受MTX药物相关基因检测制定个体化治疗方案前后不良反应比较 41例ALL患者未经过药物相关基因检测前，常规用药出现骨髓抑制3例次，消化道症状6例次，肝功能损害3例次，口腔黏膜损害9例次，恶心呕吐6例次，发生不良反应16例，不良反应发生率为39.0%。根据药物相关基因检测结果进行个体化增加亚叶酸钙解救频次，患者出现骨髓抑制1例次，肝功能损害1例次，消化道症状3例次，口腔黏膜损害4例次，恶心呕吐6例次。有患者11例发生不良反应，不良反应发生率为 26.8%。

基因检测测定调整个体化用药前后比较，χ2=9.409，P=0.002，差异有统计学意义（P＜0.05）。 该项研究结果显示，使用大剂量MTX时，不良反应的发生率分别为 CC 占 35.7%，CT 占 45%，TT 占 85.7%，即基因型为CT和TT的ALL患者对药物敏感性增加，耐受性降低，发生不良反应的风险较CC型的高。由此可见，适当降低MTX的用量或增加解救药物（亚叶酸钙）的使用剂量，可减少不良反应。见表1。

表1 MTHFR基因型与不良反应的关系

2.2 患者血药浓度监测情况及个体化用药前后不良反应比较 目前，公认的MTX中毒血药浓度为：给药后 24 h＞10 μmoL/L，48 h＞1 μmoL/L，72 h＞0.1 μmoL/L，若在给药 48 h 后血药浓度＞0.25 μmoL/L，则应加大解救剂量，增加解救次数，使72 h后血药浓度低于 0.1 μmoL/L［2］。该研究中，治疗组患者采用大剂量MTX治疗，药物基因检测前，患者48 h血浆 MTX 浓度＞1μmoL/L者 4例，占 9.8%；患者经药物基因检测并增加亚叶酸钙解救剂量及频次，48 h后血浆 MTX 浓度＞1μmoL/L者 1例，仅占 2.4%；患者给药后72 h血药浓度均低于0.1μmoL/L。

3 讨论

ALL是临床常见恶性血液系统疾病，多见于小儿，起病隐匿、进展迅速。甲氨蝶呤是用于儿童急性淋巴细胞白血病治疗的常用药物，大剂量冲击疗法的广泛应用，明显降低髓外白血病的发生，提高了患者的长期生存率。但值得注意的是由于患者的基因多态性造成不同个体对MTX的敏感性及耐受性有很大差异。MTX是一种叶酸还原酶抑制剂，5，10－MTHFR是叶酸－甲硫氨酸代谢的关键酶，其导致DNA的生物合成受到抑制，治疗中常常发生各种不良反应，主要表现为黏膜损害、肝功能异常及骨髓抑制等［3］。其基因中677位核苷酸由胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T），使得酶的活性降低，改变细胞内活性叶酸成分的分布［4］，可能使机体对MTX的敏感性增强，增加ALL患者对MTX的不良反应［5］。许宏等［6］报道的MTX在MTHFR 677CT基因型体内代谢缓慢，24 h MTX血药浓度较高，这很好地解释了MTHFR的基因多态性与MTX治疗时不良反应之间的关系。即MTHF R677C＞T可以增加MTX治疗的不良反应的发生率。研究表明，ALL与MTHFR基因型突变相关［7］。变异基因携带者对甲氨蝶呤更为敏感，对药物不良反应的耐受性降低，在使用大剂量药物时，这种情况可能会更为明显，可产生严重不良反应。临床药师将临床药学和药物基因组学结合，从基因组水平上深入认识疾病及药物作用的个体差异的机制。对急性淋巴细胞白血病患者HDMTX化疗期间，根据检测MTHFR基因型进行个体化治疗，患者药物基因检测前，患者48 h血浆MTX浓度＜0.25 μmoL/L 者 37 例，占 90.2%；血浆 MTX 浓度＞1μmoL/L者 4例，占 9.8%；不良反应发生率为39.0%，经过药物相关基因检测后，增加亚叶酸钙解救次数，患者48 h血浆MTX浓度＜0.25μmoL/L者40例，占97.6%；血浆 MTX浓度＞1μmoL/L者1例，占2.4%；出现不良反应发生率为26.8%。基因检测测定调整用药前后比较，组间差异有统计学意义（P＜0.05）。有效地减少患者严重的不良反应的发生。

综上所述，大剂量MTX治疗儿童急性淋巴细胞白血病患者通过对MTHFR的基因检测，了解患者对MTX毒性风险的高低，对风险较高，则需实施个体化给药，严格治疗规范，提早预防其不良反应的发生。出现不良反应时，及时采取相应措施，积极处理。同时血浆MTX浓度监测下，用亚叶酸钙补救，为临床与患者建立新型的临床药学模式。