高效液相色谱测定鲫鱼组织中3-甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸的残留

应寒松，钟世欢，裘钧陶，叶佳明

（浙江公正检验中心有限公司，赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009）

0 引言

卡巴氧和喹乙醇同属于喹噁啉类化合物，是促生长作用的饲料添加剂，能够提高饲料转化率和利用率，对鱼类致病菌具有抑制作用，被广泛应用于水产品的促生长和疾病防治。毒理学研究表明，卡巴氧和喹乙醇具有致癌致畸的毒副作用[1]，因此世界上大多数国家禁止在水产品养殖和治疗中使用卡巴氧和喹乙醇，我国也明文规定禁止将喹乙醇和卡巴氧用于水产养殖。喹乙醇和卡巴氧能在动物组织内迅速代谢产生的相应代谢物3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸（MQCA） 和喹噁啉- 2 -羧酸（QCA），是二者监控常用的目标残留物。

目前水产品中MQCA和QCA常用的检测方法有液相色谱法[2]、液相色谱-串联质谱法[3]和气相色谱-质谱法[4]。液质联用的方法由于仪器昂贵、检测成本高而不易推广。液相色谱法[5]目前使用酶水解提取，前处理步骤较为复杂，回收率偏低。研究通过简化前处理过程，通过酸水解前处理并使用固相萃取方法进行净化，研究建立适用于鲫鱼组织中MQCA和QCA测定的高效液相色谱法，为卡巴氧和喹乙醇代谢物检测提供灵敏度高、重现性好的定量分析方法。

1 试验设计

1.1.1 试验材料

鲫鱼，用组织研磨仪研磨，混合均匀。

氢氧化钠（分析纯）、盐酸（分析纯）、甲酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）、3-甲基喹噁啉- 2 -羧酸（纯度99.0%）、喹噁啉-2 -羧酸（纯度99.8%）、试验用水为超纯水，Dr.Ehrenstorfer公司提供；OasisMAX固相萃取柱（60 mg/3 mL），Waters公司提供。

1.1.2 仪器和试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪配备紫外检测器、AR2140型电子分析天平、IKA VORTEX GENIU 3型涡旋混合器、TGL-16G型台式离心机、KS-300EI型超声波清洗器、氮吹仪等。

1.2.1 提取

称取5 g（精确至0.01 g） 样品置于50 mL离心管中，加入10 mL 1 mol/L的盐酸溶液，涡旋混匀后超声提取10 min，以转速4 000 r/min离心10 min，取上清液，重复操作1次，合并提取液，加入10 mL正己烷，涡旋混匀，以转速4 000 r/min离心5 min，取下层水相，待用。

1.2.2 净化

将MAX固相萃取柱依次用2 mL甲醇、3 mL水活化，待试剂流至填料上层以下，加入样品提取液，控制流速在3 mL/min以下。先后用3 mL 0.05 mol/L氢氧化钠溶液和3 mL甲醇淋洗，抽干，用3 mL 2%含甲酸的乙酸乙酯溶液洗脱，洗脱液在40 ℃下氮吹吹干，用1 mL流动相复溶，涡旋混匀，以转速14 000 r/min冷冻离心5 min，取上清液供液相色谱测定。

色谱柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 nm，4.6 μm），流动相：1%甲酸水溶液和甲醇（甲酸水+甲醇=6+4）， 流速1 mL/min， 柱温30 ℃， 进样量20 μL，波长320 nm。

2 结果与分析

目前MQCA，QCA的检测标准主要依据农业部781号公告-3-2006《动物源食品中3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸残留量的测定高效液相色谱法》，该方法前处理步骤较多，采用该法再萃取和反萃取中，目标物容易损失，造成回收率偏低。试验优化提取步骤，用盐酸提取。试验分别以HCl浓度和酸解时间对水解过程进行研究，用0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mol/L的HCl溶液进行水解；水解时间选择10，20，30，40 min。试验结果表明，1 mol/L HCl溶液水解10 min即可将目标物从组织中提取出来。

鱼肉组织样品经盐酸提取正己烷去脂后，提取液含较多杂质，会对结果造成影响，采用固相萃取柱净化后，能降低基质效应的影响，提高仪器灵敏度。根据MQCA，QCA的结构，分别选择阴离子交换固相萃取柱（Oasis MAX柱）和反相固相萃取柱（Oasis HLB柱）进行净化效果考查。试验结果显示，HLB柱净化回收率为MQCA可达82.7%±2.5%，QCA可达79.3%±2.8%，MAX柱净化回收率为MQCA可达93.5%±1.6%，QCA可达94.6%±2.1%，二者均能满足MQCA，QCA的分析要求。二者比较，MAX柱回收率更高，因此选用MAX柱作为净化萃取柱。

分别配置标准溶液，质量浓度分别为0.05，0.10， 0.20， 0.50， 1.00， 2.00 μg/mL 进行分析， 根据保留时间定性，使用峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

MQCA、QCA的质量浓度在0.05～2.00 μg/mL时呈线性分布，其中QCA线性回归方程为Y=38.453 29X-0.117 32，相关系数为0.999 96；MQCA线性回归方程为Y=26.435 17X+0.339 17，相关系数为0.999 97。采用空白基质添加MQCA，QCA标准品的方法，以3倍信噪比计算检出限MQCA，QCA为4.0 μg/kg。

0.5 μg/mL的MQCA和QCA标准色谱图见图1。

图1 0.5 μg/mL的MQCA和QCA标准色谱

选取鲫鱼样品，添加不同含量的MQCA，QCA标准品，按试验方法进行处理，平行测定6份。

精密度与回收率见表1。

表1 精密度与回收率

由表1可知，QCA回收率为83.3%～88.5%，MQCA回收率为85.6%～90.2%，相对标准偏差小于5%。结果表明，此方法具有良好的准确性和可靠性。

3 结论

试验使用酸水解提取鲫鱼组织中MQCA，QCA，比较了不同浓度盐酸提取效果，通过阴离子固相萃取柱净化后，降低了基质效应，空白样品加标回收和重复性良好。通过研究，建立了鲫鱼组织中3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸的高效液相色谱法，可用于鲫鱼样品中喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物的定量分析和日常检测。