黑皮油松松针精油的超声波辅助-盐析-水蒸气蒸馏法提取及其抑菌效果和稳定性1)

2018-10-23包怡红刘文丽

东北林业大学学报 2018年10期

包怡红刘文丽

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

Ultrasonic-assisted salting-out hydrodistillation extraction method was used to extract essential oil of Pinus tabulaeformis needles. By using single factor experiment, the extraction conditions of P. tabulaeformis needles oil were optimized by orthogonal method. Combined with the disc diffusion method and microatmosphere test the antibacterial activity of essential oil of P. tabulaeformis needles were determined. Double dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC). The effects of pH, temperature and ultraviolet on the antibacterial effect of essential oil of P. tabulaeformis needles were studied. The optimum extraction conditions of essential oil of P. tabulaeformis needles are ultrasonic power of 240 W, ultrasonic time of 60 min, NaCl of 4%, and extraction time of 5 h. Three times of verification experiments show that the yield of P. tabulaeformis needles oil is 0.388 2%. P. tabulaeformis needles oil has inhibitory effects on all three strains of bacteria, and has little antibacterial effect on Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus oryzae. MICs of essential oil to Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Escherichia coli are 5, 10 and 20 μL/mL, respectively. The essential oils has good stability to temperature and ultraviolet radiation, and their antibacterial activity was unstable under different pH conditions. Antibacterial activity was strong in acid and weak in base solution.

黑皮油松(Pinustabulaeformis)为松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物，其叶为松针，常被用于医药以及食品添加剂领域，具有活血安神、消炎止痒之功效[1]，主要分布在中国东北地区。经查阅文献，对松针的研究集中在化学成分[2]、黄酮提取[3]、药理[4]、莽草酸提取及肿瘤治疗[5]等几个方面，而在松针精油提取和抑菌活性方面的研究报道很少。王得道[2]运用了水蒸气蒸馏法提取黑皮油松松针精油，并且测得了主要成分是烯烃类和芳香类，其中石竹烯含量最高。超声波辅助处理可以产生空化效应和机械剪切效应，加快分子的运动，使萃取成分与溶剂充分混合，有助于内容物的溶出[6-7]。盐析效应是为了强化有机物的分离效果，在水蒸气蒸馏中加入某种无机盐，在含水体系中，盐可以通过亲和力“氢键”离子的静电等作用与溶液中某种组分发生优先溶剂化反应，形成难挥发的化合物，从而减少了该组分与另一组分之间的吸引作用[8]。

植物精油具有良好的抑菌抗炎活性[9]，由于现有的化学抑菌剂副作用较大，精油作为天然成分更适合用于食品的保鲜防腐。本试验采用超声波盐析辅助的方法提取黑皮油松松针中的精油，且以精油得率为指标，采用L9(34)正交表进行实验，进行最佳工艺条件的确定，并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物的抑制作用进行了研究，此外，还探讨了热处理、pH值和紫外线照射条件对精油抑菌稳定性的影响，对开发天然食品防腐剂及保鲜剂具有重大的意义，为黑皮油松松针精油的开发应用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑皮油松松针采于东北林业大学校园，将其晾干后用万能粉碎机打碎；NaCl固体购于天津基准化学试剂有限公司；牛肉膏、蛋白胨、营养琼脂购于北京奥博星生物技术有限责任公司；吐温-80购于天津市光复精细化工研究所提供；葡萄糖购于天津市恒兴化学试剂制造有限公司；大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.auTeus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、米曲霉(Aspergillus)，所有供试菌种均来源于东北林业大学微生物实验室。

水蒸气蒸馏装置实验室自备；电子天平购于常熟市天量仪器有限责任公司；高速多功能粉碎机购于上海市顶帅工贸有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器购于昆山市超声仪器有限公司；高压蒸汽灭菌锅购于上海博讯实业有限公司；电热恒温培养箱购于天津市泰斯特仪器有限公司；恒温水浴锅购于上海一恒科技有限公司。

1.2 试验方法

黑皮油松松针精油的提取：称取50 g粉碎后的黑皮油松松针置于圆底烧瓶中，加入一定质量分数的NaCl溶液在不同的超声功率下处理一定的时间，回流后收集称其质量，重复3次，精油提取率按(1)式计算。

(1)

式中：E为精油得率(%)；m1为精油质量(g)；m2为松针质量(g)。

超声功率的影响：称量粉碎后的黑皮油松松针粉50 g，NaCl质量分数为2%的条件下，分别在180、210、240、270、300 W超声功率下处理30 min，水蒸气蒸馏3 h后，计算得率。

超声时间的影响：称量粉碎后的黑皮油松松针粉50 g，NaCl质量分数为2%，超声功率为270 W的条件下，分别处理15、30、45、60、75 min，水蒸气蒸馏3 h后，计算得率。

NaCl质量分数的影响：称量粉碎后的黑皮油松松针粉50 g，超声功率为270 W的条件下,NaCl质量分数分别为2%、4%、6%、8%、10%，超声处理30 min，水蒸气蒸馏3 h后，计算得率。

蒸馏时间的影响：称量粉碎后的黑皮油松松针粉50 g，NaCl质量分数为2%，超声功率为270 W的条件下，分别进行水蒸气蒸馏1、2、3、4、5 h后，计算得率。

正交试验：在单因素的基础上设计超声功率、超声时间、NaCl质量分数和蒸馏时间4因素的L9(34)正交实验，确定黑皮油松松针精油最佳提取工艺条件。

1.3 精油抑菌试验

菌悬液的制备：取活化之后的菌体于相应的液体培养基中，细菌于37 ℃中培养至对数生长期，用平板计数法将菌悬液调整浓度为每毫升106～107个菌落群，真菌于28 ℃中培养至对数生长期，并用血球计数法调整菌的浓度至每毫升106～107个菌落群，备用[10]。

黑皮油松松针精油的制备：将精油溶于灭菌后的吐温-80溶液中制备成体积分数为10%的精油溶液，置于4 ℃中冷藏保存备用。

黑皮油松松针精油液相抑菌活性的测定：根据文献[11]，测定黑皮油松松针精油对5种供试菌的抑菌活性。在无菌条件下，将培养基倒入灭过菌的平板后冷却凝固，取100 μL菌悬液于培养基上并涂布均匀，取4片灭好菌的滤纸片(直径为6 mm)放置于含菌平板上，其中3片滴加10 μL体积分数为10%的精油溶液，另外1片以10 μL吐温-80溶液作为对照，细菌放置于37 ℃中培养24 h，真菌放置于28 ℃中培养48 h。多次试验后用交叉法测得抑菌圈的直径大小。

最低抑菌体积分数测定：根据文献[12]，取4 mL液体培养基加入灭完菌的试管中，再加入1 mL用吐温-80溶液倍比稀释过的黑皮油松松针精油溶液，使得精油的体积分数为0.625～40 mL/L，以1 mL质量分数为0.1%的吐温-80溶液作为对照，每支试管中加入菌悬液100 μL，振荡摇匀后将其置于37 ℃中恒温振荡培养24 h。从各试管中分别取100 μL于平板上并涂布均匀，放于37 ℃培养24 h。

黑皮油松松针精油气相抑菌活性的测定：根据文献[13]，取100 μL菌液于培养基上并涂布均匀，取一片直径大小为25 mm的滤纸片置于培养皿盖中央，向滤纸片中滴加50 μL的纯精油，以50 μL无菌水作为对照，将培养皿密封置于37 ℃中培养24 h。

温度对黑皮油松松针精油抑菌效果的影响：将体积分数10%的精油置于20、40、60、80、100 ℃处理15 min，空白组不进行处理，进行抑菌试验。

pH值对黑皮油松松针精油抑菌效果的影响：用质量分数2%的NaOH溶液和体积分数50%的柠檬酸将质量分数0.1%吐温-80的pH值分别调为4、5、6、7、8、9、10，再将精油稀释至体积分数10%，空白组不进行处理，同时设置不同pH值的吐温-80溶液为对照组，进行抑菌试验。

紫外线对黑皮油松松针精油抑菌效果的影响：将体积分数为10%的精油分别在紫外灯(功率为20 W，垂直距离35 cm)下处理10、20、30、40、50、60 min，空白组不进行处理，进行抑菌试验。

数据分析：实验数据以平均值±标准差表示，所有数据利用Word2016、Excel2016、SPSS 22.0、Origin 8.0统计和绘图，进行数据方差显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素对黑皮油松松针精油提取率的影响

超声功率对黑皮油松松针精油得率的影响：由表1可知，随着超声功率的改变，精油得率先上升后下降。其原因可能是超声功率增大导致空化作用也逐渐增强，加速了细胞的破碎速度，使得精油有效成分加快渗出，精油得率提高；但当超声功率过大时则空化效应增强的幅度过大，使得精油更多得损失于水介质中。

表1 超声功率对精油得率的影响

注:表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著(p<0.05)。

超声时间对黑皮油松松针精油得率的影响：由表2可知，随着超声时间的增加，精油的得率也相对增加，当超声时间到达45 min时，黑皮油松的得率基本趋于稳定并且有所下降。这与李敏杰等[14]使用超声波辅助提取葛缕子精油的结果一致，这可能是因为随着超声时间的增加，细胞的破碎程度增加，有助于精油进入溶剂中，随着时间的增长，超声产生的热效应加速升高温度，使得精油中易挥发氧化的物质损失，因此精油得率开始下降。

表2 超声时间对精油得率的影响

注:表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著(p<0.05)。

NaCl质量分数对黑皮油松松针精油得率的影响：由表3可知，精油的得率随着NaCl质量分数的增加也相对增加，但是当NaCl质量分数超过4%，精油得率就开始减少。这与闫旭宇等[15]盐析辅助提取灵香草精油结果一致，精油得率随着NaCl质量分数的增加而增加，超过4%时，精油得率开始下降。这可能是由于加入无机盐可增大细胞内外的渗透压，更易于精油的溶出，NaCl质量分数过高时精油提取率下降主要是因为盐浓度升高，水蒸汽沸点升高而蒸馏温度升高，导致精油损失增加[16]。

蒸馏时间对黑皮油松松针精油得率的影响：由表4可知，当蒸馏时间从1 h到4 h时，随着时间的增长，精油的得率不断升高，当到达4 h之后精油得率趋于平稳并且开始有所下降，原因是随着时间的增长，精油中不稳定的成分发生损失，使得精油得率下降。

表3 NaCl质量分数对精油得率的影响

注:表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著(p<0.05)。

表4 蒸馏时间对精油得率的影响

注:表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著(p<0.05)。

2.2 超声波盐析辅助提取黑皮油松松针精油的条件优化

结合单因素试验结果，以超声功率、超声时间、NaCl质量分数、蒸馏时间为影响因素，以提取率为考察指标，进行L9(34)正交试验，因素水平见表5。

9组正交试验获得的精油得率分别为0.293 2%、0.321 8%、0.337 4%、0.385 9%、0.359 7%、0.368 9%、0.352 6%、0.366 1%、0.382 6%。由各因素极差R的大小可知，RA>RC>RB>RD，影响得率的因素由大到小是超声功率、NaCl质量分数、超声时间、蒸馏时间，超声功率为主要影响因素，蒸馏时间为不重要因素。由k值可得，最佳水平为A2B3C2D3，即超声功率为240 W，超声时间为60 min，NaCl质量分数为4%，蒸馏时间为5 h，在此条件下进行验证试验，设置3组平行试验，最终得到黑皮油松松针精油得率为0.388 2%(n=3)。本试验优化提取的黑皮油松松针精油得率高于王得道[2]研究的得率0.254%，这说明超声波和盐析辅助有助于精油得率的提高。

表5 正交试验因素水平

2.3 黑皮油松松针精油抑菌活性

黑皮油松松针精油的液相抑菌活性：黑皮油松松针精油对5种微生物的液相抑制作用结果见表6，对3种细菌均表现出抑菌效果，对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，对金黄色葡萄球菌的抑制作用居中，抑制作用最弱的为大肠杆菌，这可能是由于革兰氏阴性菌的细胞壁较革兰氏阳性菌的细胞壁更为复杂，能够阻止精油的抑菌成分进入细胞中，起到保护的作用；对酿酒酵母和米曲霉的抑菌效果较差，几乎没有检测到抑菌圈。

表6 黑皮油松松针精油的液相抑菌生物活性测定结果

注:表中数据为平均值±标准差；“—”表示无抑菌效果。

黑皮油松松针精油的最低抑菌体积分数：由于抑菌圈试验表明黑皮油松松针精油对酵母菌和米曲霉抑菌效果不明显，因此选取了对精油较敏感的3种细菌进行了最低抑菌浓度的测定，后面试验均以这3种菌作为研究对象。

由表7可以看出，黑皮油松松针精油对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌最低抑菌体积分数分别是5、10、20 mL/L，可见精油对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好。

表7 黑皮油松松针精油对供试菌的最低抑菌体积分数

黑皮油松松针精油的气相抑菌活性：结果见表8，黑皮油松松针精油对3种供试菌均具有抑菌效果，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，枯草芽孢杆菌次之，作用最弱的为大肠杆菌。对革兰氏阳性菌作用比革兰氏阴性菌强，但抑制金黄色葡萄球菌的作用强于枯草芽孢杆菌。这种差异可能是由于液相抑菌法是直接接触测定法，其主要取决于扩散性和溶解度，而气相抑菌则主要依赖于精油化合物的挥发性[17]。

表8 黑皮油松松针精油的气相抑菌生物活性测定结果

注：表中数据为平均值±标准差；“—”表示无抑菌效果。

温度对黑皮油松松针精油抑菌活性的影响：由表9可见，在20，40，60，80，100 ℃下处理后，与对照组相比，黑皮油松松针精油的抑菌活性基本维持稳定。这与王步江等[18]人的研究结果一致。这表明加热并没有使精油中的抑菌成分发生改变，黑皮油松松针精油的有效成分对温度的耐受性较好。

表9 温度对黑皮油松精油抑菌活性的影响

注：表中数据为平均值±标准差。

酸碱环境对黑皮油松松针精油抑菌活性的影响：由表10可见，pH值的改变会影响黑皮油松松针精油对细菌的抑制作用。在pH值<8时，随着pH值的降低，抑菌圈增大，在pH值>8时，随着pH值的增大，抑菌圈稍有增大。对照组在强酸和强碱时表现出对细菌的抑制作用。这与刘玉民等[19]人的试验结果一致。精油在低pH条件下抑菌活性增强是由于在酸性条件下细菌自身的生理活性降低，同时精油的活性成分的结构形式也发生改变，即pH值的降低能够使精油中酚类化合物上所带羟基的电离度降低，疏水性增强，更易于与细菌的细胞膜和脂蛋白相结合，从而提高抑菌活性[20]。pH值>8时，细菌在碱性条件下不易于生长导致抑菌能力的增强。因此，在酸性条件下精油的具有更好的抑菌作用。

表10 pH值对黑皮油松松针精油抑菌活性的影响

注：表中数据为平均值±标准差。

紫外线照射对黑皮油松松针精油的抑菌活性的影响：由表11可见，紫外线分别照射10，20，30，40，50，60 min之后，与对照组相比，黑皮油松松针精油的抑菌活性并未发生显著的变化。这与李娅男等[21]人研究的紫外线对4种精油稳定性的影响的结果一致。这表明黑皮油松松针精油对紫外线具有较高的稳定性，紫外线对精油的成分及其结构没有产生影响。