PEG-6000和NaCl胁迫对转GbWRKY32基因烟草种子萌发及苗期生长的影响

郭丁，曲延英，倪志勇，陈全家

(新疆农业大学农业生物技术重点实验室，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】干旱、盐碱、高温、冷害等非生物胁迫是影响植物生长发育和作物产量的主要因素[1]。其中最关键的非生物胁迫是盐碱以及干旱胁迫。在全世界干旱和半干旱耕地占总耕地面积的42.9%[2]。我国干旱以及半干旱耕地占总耕地面积的48%。20世纪60年代全世界盐渍化耕地面积将达到50%[3]。我国的盐渍化土地面积占国土面积的2.71%[4]。干旱以及土地盐渍化问题是全球农业生产中首先需要克服的难题[5]。传统育种方法相对于分子育种方法而言并不能高效的准确的改善非生物胁迫对作物的影响，基因表达调控不仅揭示了植物非生物胁迫的作用机理，而且利用非生物胁迫相关基因提高植物抵御非生物胁迫的能力已成为植物抗逆基因工程研究的重要方向[6]。【前人研究进展】WRKY转录因子普遍的存在植物界中，并且是植物中一类功能及数量都比较大多转录因子家族。WRKY转录因子蛋白包括一个或两个保守的WRKYGQK序列，并且C端常有锌指结构[7]。目前报道最多的就是植物中的WRKY转录因子在应对外界生物以及非生物胁迫对逆境的防御方面[8]。例如大豆中的GmWRKY13 基因[9]与拟南芥中的AtWRKY75基因[10]与侧根的生长有关;水稻的OsWRKY31基因也和侧根的形成以及延伸相关[11]。拟南芥中的AtWRKY6基因和水稻中的OsWRKY23基因可引发衰老的进程，而AtWRKY70基因对植物的衰老反应有负调控作用[12-14]。拟南芥中的AtTGG2是一个编码WRKY转录因子的基因，它影响拟南芥表皮毛状体和种皮的形成[15]。另外，WRKY转录因子也参与植物的一些新陈代谢的过程，如大麦中的SUSIBA2基因参与了体内的糖代谢过程[16]，棉花中的GaWRKYl基因调控生物合成倍半烯[17]。水稻中OsWRKY71基因以及大麦中的HvWRKY38基因通过抑制糊粉细胞中GA诱导的α-锭粉酶的活性，以此抑制种子的萌发[18-21]。Zhou等[9]研究发现过量表达大豆GmWRKY54的拟南芥植株对干旱和盐害具有一定的忍耐性。水稻的OsWRKY11增加植株体内棉籽糖的含量，增强了水稻的抗旱性[22]。BhWRKY1通过调控BhGolS1的表达，促进转BhGolS1基因烟草的体内ROFs的积累，增强了转基因烟草的抗旱性[23]。过量表达拟南芥中的TaWRKY2与TaWRKY19，可以提高转基因植株的抗旱性以及耐盐性[24]。【本研究切入点】当前对WRKY32转录因子在植物中的非生物胁迫应答研究相对较少。采用干旱以及盐胁迫对转GbWRKY32基因烟草以及野生型烟草种子的发芽率、根系扫描、干重以及鲜重的差异性，分析转GbWRKY32基因烟草以及野生型烟草的抗旱及耐盐性。【拟解决的关键问题】通过对转GbWRKY32基因烟草以及野生型烟草的抗旱、耐盐性分析，研究GbWRKY32基因在植物中的非生物胁迫的作用，为抗旱耐盐提供备选基因。

1 材料与方法

1.1 材 料

转GbWRKY32基因烟草以及本生烟草(非转基因)种子由新疆农业大学遗传育种实验室提供。其中转GbWRKY32基因烟草13号、12号8号为经Real-time PCR检测后基因表达量较高的三个株系[25]，并经纯化筛选后得到第2代转GbWRKY32基因烟草。

1.2 方 法

1.2.1 干旱胁迫下种子发芽及幼苗生长

用70%的无水乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3～4次然后用0.5%次氯酸钠溶液消毒种子15 min，无菌水清洗5～6遍，然后置于铺有2层滤纸的(直径9 cm)培养皿中发芽，每个培养皿中加入2 mL10%、15%、20% PEG-6000作渗透介质模拟干旱，所形成的水势约为-0.4 MPa。对照组用2 mL去离子水代替PEG-6000溶液加入到每个培养皿中。

1.2.2 盐胁迫下种子发芽及幼苗生长

用70%的无水乙醇消毒30 s，无菌水冲洗3～4次然后用0.5%次氯酸钠溶液消毒种子15 min，无菌水清洗5～6遍，点播于含有0、100、150和200 mmol/L NaCl的1/2MS培养基上。

1.2.3 指标测定

种子置床后用Parafilm封口膜密封培养皿。黑暗20℃(12 h)，光照30℃(12 h，光照强度4 000 lx)变温发芽。试验重复3次，每重复100粒种子。每天记录发芽种子数，第16 d计算发芽率、发芽指数(GI)和活力指数(VI)。计算公式:GI=∑(Gt/Dt)，VI=S×GI，式中:Gt为第t天的发芽种子数，Dt为发芽日数，S为全苗长(cm)[26]。随机选取生长16 d的幼苗50株，测定幼苗全长、根系。全苗鲜重、干重。将幼苗在80℃下烘干24 h，测定幼苗全苗干重。

1.3 数据处理

所得数据均用Excel软件进行数据处理以及SPSS19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 PEG胁迫对转GbWRKY32基因烟草出苗率的影响

研究表明，本生烟草以及转GbWRKY32基因烟草种子的发芽率在5% PEG、10% PEG、15% PEG浓度与对照0 mM NaCl浓度之间均有极显著性差异(P<0.01)差异值分别为0.862、0.585、0.585。在正常处理下，本生烟草、转GbWRKY32基因13号、12号以及8号的出苗率分别是96.25、96.6、96.8、96.6；在5% PEG胁迫中出苗率相比正常处理下分别下降0.82%、0.79%、0.86%、0.8%；在10% PEG胁迫中出苗率相比正常处理下分别下降2.94%、2.93%、3.4%、3.1%；在15% PEG胁迫中出苗率相比正常处理下分别下降4.75%、4.01%、4.06%、4%，说明种子出苗率随着PEG浓度的增加而降低。在15% PEG胁迫处理中本生烟草的出苗率比转GbWRKY32基因13号、12号以及8号的出苗率分别降低0.74%、0.69%、0.75%，转GbWRKY32基因烟草种子的出苗率在旱胁迫中要高于本生烟草。在干旱胁迫16 d后，本生烟草以及转GbWRKY32基因13号、12号以及8号的种子活力随着PEG胁迫浓度的增加其活力不断下降，当PEG胁迫浓度达到5%时本生烟草的种子活力明显低于转GbWRKY32基因13号、12号以及8号的种子活力。在15% PEG胁迫处理中转GbWRKY32基因13号、12号以及8号的种子活力比本生烟草种子活力高2.37、2、1.69倍。转GbWRKY32基因烟草种子活力在旱胁迫中要明显高于本生烟草。图1

注：a、b图中的数据分别来自三个独立试验的平均值±标准差，根据Duncan的测试，柱上的不同字母表示极显著性差异(P<0.01)
Note: The data in figures a and b are from the mean ± standard deviation of three independent experiments.According to Duncan's test,the different letters on the column indicate extremely significant differences (P<0.01)

图1 PEG胁迫下转GbWRKY32基因烟草出苗率以及活力指数变化
Fig.1 Effect of PEG stress on seedling emergence and vigour index of GbWRKY32 transgenic tobacco

2.2 不同浓度PEG胁迫对烟草幼苗根系影响

研究表明，在15%的PEG胁迫中，转GbWRKY32基因烟草以及本生烟草的根系形态学参数达到最低。PEG对照中转GbWRKY32基因8号的总根长明显高于其他材料。在PEG对照中本生烟草以及转GbWRKY32基因13号、12号、8号的根系总长度和根系总表面积分别是1.109、1.495、1.301、1.533 cm和0.063、0.134、0.114、0.073 cm2;在15%PEG胁迫中，烟草的幼苗的根系总长度和总表面积分别是正常对照的0.357、0.681、0.367、0.419倍和0.619、0.724、0.711、0.945倍，其中转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的根系总长度和总表面积比本生烟草分别增加了0.324、0.01、0.062倍和0.105、0.092、0.326倍，说明转GbWRKY32基因烟草的根长以及根总表面积均优于本生烟草。在不同径级根系长度0.0≤TN<0.5里，其径级根系长度随着PEG浓度的增加而降低。15% PEG处理中，在0.5≤TN<1.0里，野生型烟草径级根系长度以及径级根尖数均为0，转GbWRKY32烟草13号、12号、8号的径级根系长度以及径级根尖数分别为0.67、0.03、0.09 cm和0.2、0.63、0.198；说明在15%的PEG胁迫下转GbWRKY32烟草的根系以及根尖数比本生烟草长、多。在PEG对照中其本生烟草以及转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的在0.0≤TL<0.5径级根尖数分别是0.686、1.824、1.214、0.843，在15%PEG胁迫中，烟草幼苗的径级根尖数分别是PEG正常对照的0、0.088、0.129、0.498倍，其中转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的径级根尖数分别比本生烟草增加了0.088、0.129、0.498倍，说明转GbWRKY32基因烟草的侧根的生长发育比本生烟草好。表1

表1 不同浓度PEG胁迫下烟草幼苗根系变化Table 1 Effects of different concentrations of PEG stress on root system of tobacco seedlings

注：表中的数据分别来自三个独立试验的平均值±标准差，根据Duncan的测试，表中不同字母表示不同处理间的显著性差异(P<0.05)，表2-2、2-3、2-4同上
Note: The data in Table are from the mean ± standard deviation of three independent experiments,respectively.According to Duncan's test,the the significant differences between different treatments (P<0.05).The table 2-2,2-3,2-4 below is the same as above

2.3 不同浓度PEG胁迫对烟草幼苗株高以及物质的量的影响

研究表明，本生烟草以及转GbWRKY32基因株系13号、12号、8号在正常处理中株高分别是1.309、1.495、1.301、1.333 cm，在15%PEG胁迫中其株高与正常处理相比分别下降69.75%、38.19%、40.27%、50.64%。在正常处理中本生烟草与转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的鲜质量与干质量分别是57.3、77.3、72.35、66.4 g和4.25、4.1、4.15、4.4g；在15%PEG胁迫处理中四个烟草品种的鲜质量比正常处理降低了64.86%、54.26%、58.09%、61.71%，说明在PEG胁迫下转GbWRKY32基因烟草幼苗的物质的量的积累比本生烟草高。全苗含水量随着PEG胁迫程度的加重不断降低。在PEG胁迫下GbWRKY32基因可能缓解烟草幼苗在胁迫中生长受到的抑制，减少了物质的量的降低。表2

表2 不同浓度PEG胁迫下烟草幼苗株高以及物质的量变化Table 2 Effects of different concentrations of PEG Stress on plant height and substance amount of tobacco seedlings

2.4 盐胁迫对转GbWRKY32基因烟草出苗率的影响

研究表明，本生烟草以及转GbWRKY32基因烟草种子的活力指数在100 mM、150 mM NaCl浓度与对照0 mM NaCl浓度之间有显著性差异(P<0.05)差异值均为0.394。当NaCl浓度达到200 mM时转GbWRKY32基因8号与本生烟草的发芽率之间存在0.003的显著性差异(P<0.05)。本生烟草以及转GbWRKY32基因烟草种子的发芽率随着 NaCl浓度的不断升高而下降。在100 mM NaCl的胁迫处理下，转GbWRKY32基因株系8号的出苗率相对于其他品种较高，为88%，另外两个转GbWRKY32基因株系的出苗率均低于本生烟草，分别为69.3%、75.7%；在150 mM NaCl的出苗率明显低于100 mM NaCl胁迫处理，随着盐胁迫的加重种子的活力及其出苗率降低；在150 mM NaCl的胁迫处理下转GbWRKY32基因三个株系的种子发芽率明显高于本生烟草，其发芽率分别是26.40%、33.60%、45.40%、55.70%，分别比本生烟草种子的发芽率高7.2%、19%、29.3%，转GbWRKY32基因烟草种子的种子发芽率比本生烟草种子高，并且差异显著。随着NaCl浓度不断增加，本生烟草与转GbWRKY32基因烟草的种子活力不断下降。当NaCl浓度达到150 mM 时本生烟草与转GbWRKY32基因烟草种子活力出现明显差异，转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号分别是本生烟草种子活力的1.6、2.25、2.19倍。当 NaCl浓度达到200 mM时，转GbWRKY32基因烟草以及本生烟草种子的发芽率比150 mM NaCl浓度时明显下降，尤其是本生烟草种子的活力下降到0.01。种子活力随着盐浓度的增加不断下降，出苗率也在降低。图2

注：a、b图中的数据分别来自三个独立试验的平均值±标准差，根据Duncan的测试，柱上的不同字母表示显著性差异(P<0.05)
Note: The data in panels a and b are from the mean ± standard deviation of three independent experiments,respectively.According to Duncan's test,different letters on the column indicate significant differences (P<0.05)

图2 盐胁迫下转GbWRKY32基因烟草出苗率(a)以及活力指数(b)变化
Fig.2 Effect of salt stress on seedling emergence(a) and vigor index(b) of transgenic tobacco GbWRKY32

2.5 不同浓度NaCl胁迫对烟草幼苗根系影响

研究表明，在200 mM NaCl胁迫中，转GbWRKY32基因烟草以及本生烟草的根系形态学参数达到最低。NaCl对照中转GbWRKY32基因13号的总根长明显高于其他材料。在NaCl对照中本生烟草以及转GbWRKY32基因13号、12号、8号的根系总长度和根系总表面积分别是3.203 8、4.212 6、3.714、3.657 cm和0.291、0.313、0.238、0.222 cm2;在200 mM NaCl胁迫中，烟草的幼苗的根系总长度和总表面积分别是正常对照的0.147、0.299、0.447、0.402倍和0.028 5、0.332、0.434、0.518倍，其中转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的根系总长度和总表面积比本生烟草分别增加了0.152、0.3、0.255倍和0.304、0.405 5、0.489倍，说明转GbWRKY32基因烟草的根长以及根总表面积均优于本生烟草。在不同径级根系长度0.0≤TN<0.5，其径级根系长度随着NaCl浓度的增加其本生烟草与转GbWRKY32基因烟草13号的根系长度先增加后减少，其他两个转基因株系的根长随着NaCl浓度的增加而减少。200 mM NaCl处理中，在0.5≤TN<1.0里，本生烟草以及转GbWRKY32基因三个株系其径级根系长度以及径级根尖数均为0，在0.0≤TL<0.5本生烟草以及转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的的径级根系长度分别是正常对照的0.193、0.334、0.443、0.399倍。其中转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的径级根长分别比本生烟草增加了0.141、0.25、0.206倍，说明在200 mM NaCl胁迫下转GbWRKY32烟草的根系比本生烟草长。说明转GbWRKY32基因烟草的根长的生长发育比本生烟草好。表3

2.6 不同浓度NaCl胁迫对烟草幼苗株高以及物质的量的影响

研究表明，本生烟草以及转GbWRKY32基因株系13号、12号、8号在正常处理中株高分别是3.0038、4.0126、3.514、3.457 cm，在200 mM NaCl胁迫中其株高与正常处理相比分别下降90.98%、73.55%、58.45%、63.26%；其三个转GbWRKY32基因株系分别比本生烟草在株高下降率高17.43%、32.53%、27.72%，说明在200 mM NaC胁迫中转GbWRKY32基因株系比本生烟草株高高。在正常处理中野生型烟草与转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的鲜质量与干质量分别是380.33、520.33、427.17、422.67 mg和12.97、18.5、15.6、16.6 mg；在200 mM NaCl胁迫处理中转GbWRKY32基因株系与本生烟草的鲜质量和干质量分别比正常处理降低了71.52%、66.35%、57.08%、50.71%和60.44%、41.45%、28.21%、26.7%，其中转GbWRKY32基因13号、12号、8号的鲜重、干重在200 mM NaCl胁迫中分别比本生烟草下降率高5.17%、14.44%、20.81%，18.94%、32.23%、33.74%，说明在NaCl胁迫下转GbWRKY32基因烟草幼苗的物质的量的积累比本生烟草高。全苗含水量随着NaCl胁迫程度的加重不断降低。在NaCl胁迫下GbWRKY32基因可能缓解烟草幼苗在胁迫中生长受到的抑制，减少了物质的量的降低。表4

表3 不同浓度NaCl胁迫下烟草幼苗根系变化Table 3 Effect of NaCl stress at different concentrations on the root of tobacco seedlings

表4 不同浓度NaCl胁迫下烟草幼苗株高以及物质的量变化Table 4 Influence of NaCl stress at different concentrations on plant height and substance amount of tobacco seedlings

3 讨 论

种子在干旱或者盐胁迫的处理中通过种子萌发情况可以进一步反映出种子对干旱或者盐胁迫的抵御能力。刘玲玲等[27]以及许灵杰等[28]在对烟草种子萌发试验时发现烟草种子的萌发率会随着PEG胁迫程度的加重而不断降低，并且PEG对烟草种子萌发具有明显的抑制作用。马文广等[30]通过对烟草幼苗生长指标的测定结果表明，耐旱、耐盐性强的烟草通过减少胁迫对自身的伤害，使得自身物质的量的积累增加、幼苗生长较快。实验研究表明，在干旱胁迫对种子萌发以及幼苗生长特性实验中，PEG胁迫对烟草种子的发芽率具有抑制作用，抑制程度随着PEG浓度的升高而增加，并且对本生烟草种子萌发的抑制更加明显。在15% PEG胁迫处理中本生烟草的出苗率比转GbWRKY32基因13号、12号以及8号的出苗率分别降低0.74%、0.69%、0.75%，与彭耀东等[29]对PEG对烟草种子萌发率无明显效应结果不一致。可能是GbWRKY32基因通过增加种皮的通透性使烟草种子的吸水速率加快，进而促进了转GbWRKY32基因烟草种子的萌发过程。株高、根表面积、体积以及全苗含水量随着PEG胁迫程度的加重不断降低。在PEG胁迫下GbWRKY32基因可能缓解烟草幼苗在胁迫中生长受到的抑制，减少了物质的量的降低。但在15% PEG胁迫转GbWRKY32基因烟草三个株系的株高、根表面积、体积以及全苗含水量及物质的量均优于本生烟草，转GbWRKY32基因促使烟草幼苗的生长，增加了干物质的积累，降低了干旱对种子及幼苗的胁迫。

NaCl胁迫对种子萌发以及幼苗生长特性实验表明，NaCl胁迫对烟草种子的发芽率具有明显抑制作用，抑制程度随着NaCl浓度的升高而增加，并且对本生烟草种子萌发的抑制更加明显。在200 mM NaCl胁迫下转GbWRKY32基因烟草幼苗的株高、根表面积、体积以、全苗含水量及物质的量的积累比本生烟草高。说明在NaCl胁迫下GbWRKY32基因可能通过减低细胞膜的渗透作用从而缓解烟草幼苗在胁迫中生长受到的抑制，增强了烟草对NaCl的胁迫反应，这与Jiang等[31]的研究结果相一致。

通过对转GbWRKY32基因烟草种子在干旱、盐胁迫中的萌发试验研究得知，在正常对照中转GbWRKY32基因植株的生长状况与本生烟草的生长状况差异不显著。说明外源基因的导入并没有影响烟草的生长。在干旱及盐胁迫中，转GbWRKY32基因烟草的生长状况要优于本生烟草，说明外源的GbWRKY32基因提高了烟草对干旱以及盐的耐受性。

4 结 论

转GbWRKY32基因烟草在抗旱以及耐盐两个方面的能力均优于本生烟草，并有显著性差异，在15% PEG胁迫处理中转GbWRKY32基因13号、12号以及8号的种子活力比本生烟草种子活力高2.37、2.00、1.69倍；在150 mM NaCl胁迫转GbWRKY32基因烟草三个株系的种子活力分别是本生烟草的1.60、2.25、2.19倍。在PEG-6000浓度达到15%处理14天后，转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的根系总长度和总表面积比本生烟草分别增加了0.324、0.01、0.062倍和0.105、0.092、0.326倍；其株高分别比本生烟草在株高方面其下降幅度低31.56%、29.48%、19.11%；其鲜重分别比本生烟草下降幅度低10.6%、6.77%、3.15%，三个转GbWRKY32基因烟草株系的种子全苗长、根系以及干重、鲜重明显高于本生烟草种子；随着NaCl浓度的不断上升，其整体趋势与PEG胁迫相同；在200 mM NaCl胁迫中，转GbWRKY32基因烟草以及本生烟草的根系形态学参数达到最低，转GbWRKY32基因烟草13号、12号、8号的根系总长度和总表面积比本生烟草分别增加了0.152、0.3、0.255倍和0.304、0.4055、0.489倍；其株高分别比本生烟草在株高方面其下降幅度低17.43%、32.53%、27.72%；鲜重、干重分别比本生烟草下降幅度低5.17%、14.44%、20.81%，18.94%、32.23%、33.74%；处理14天以后三个转GbWRKY32基因烟草株系的种子全苗长、根系以及干重、鲜重明显高于本生烟草种子，并推测GbWRKY32可通过多种胁迫响应正调控植物的抗旱耐盐性。