补饲大蒜素对伊犁马抗疲劳及免疫力的影响

莫绪成，曾亚琦,2，王建文,2，孟军,2，姚新奎,2，赛亚热·艾尼玩尔，梅香

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学马产业研究院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】大蒜素作为绿色饲料添加剂，在畜禽生产中应用较多。不同动物的机体生理活动不完全相同，故大蒜素对其作用效果、影响机理也存在一定区别，补饲适量的大蒜素可以作用于家禽的免疫系统从而影响机体的免疫球蛋白分泌，另一方面，大蒜素也可以作用于运动属性动物机体的乏氧诱导因子生成，从而减少缺氧状态下组织细跑的损害。因此，通过试验逐步认识大蒜素在运动马日粮中的添加效果，深入探讨其作用机理，并选择出适宜的补饲剂量，对于运动马的健康具有重要的理论价值与实践意义，也可以为运动马饲料添加剂的研发做参考依据，为运动马的科学饲养管理提供理论参考。【前人研究进展】现有研究普遍认为大蒜素是一种天然植物性广谱抗生素，具有增强机体免疫力、抗氧化、清除自由基等功能，在各种动物饲料中添加大蒜素，能够提高动物的成活率，减少患病率[1,2]。张小永等[3]研究认为补饲大蒜素能够实现增强动物机体非特异性免疫功能的效果。大蒜素可通过影响机体运动的自由基代谢、心肌与骨骼肌的微损伤程度、炎症反应和心血管调节能力等方面，来缓解运动性疲劳[4,5]。【本研究切入点】目前国内对于大蒜素的应用研究主要集中在提高动物免疫力方面，而针对大蒜素的抗疲劳作用也有一些初步的研究[6]。目前，将大蒜素的免疫作用和抗疲劳作用运用在同一试验对象上的研究较少，试验通过研究补饲不同剂量大蒜素对伊犁马运动后血液指标的变化规律，研究大蒜素对运动型马匹的抗疲劳和增强免疫能力的影响。【拟解决的关键问题】通过对四组伊犁马测试赛后即刻血液进行检测，分析不同剂量组马匹运动后血液指标的变化规律以及大蒜素抗疲劳和增强机体免疫力的作用效果，量化大蒜素补饲剂量，为伊犁马的日常生产提供数据支持，为马匹健康养殖提供技术保障。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物

试验地点位于新疆伊犁哈萨克自治州昭苏县西域赛马场。

选取16匹3～4岁健康伊犁马母马为试验动物，体尺、体重相近，试验前马匹均进行较为系统地调教训练，试验过程中所有马匹进行集中饲养管理。试验马匹均由新疆昭苏县西域马业有限责任公司提供。

试验马匹采用单厩饲养管理模式，粗饲料(干牧草)每匹马每天的饲喂量要保证充足(自由采食)，自由饮水。饲喂粗饲料时间为每天早上08:00，13:30，18:00 和23:00。马厩按规定时间打扫，粪便和垫料要及时清除，按时为圈舍换干燥柔软的垫草，保持圈舍舒适条件，确保马匹长期处于舒适状态。

1.1.2 试验器材

德国产H/P/cosmos便携式血乳酸分析仪(含试片)、真空采血管(含采血针)、离心机、保温箱、移液枪(含枪头)、日立 7600系列自动生化分析仪、MAGLUMI 4000 Plus全自动化学发光免疫分析仪等。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

将所选马匹随机分为4组(对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组)，每组4匹。每匹马每天补饲4 kg精料(分两次饲喂，每次2 kg)，每次补精料的时间为08:20，18:20。对照组精料中不添加大蒜素，试验I组、II组和III组精料中分别添加大蒜素100、300和500 mg/kg[7]。在补喂精料时，将预先称量封装好的大蒜素分别按剂量拌入其中，采食结束后，将马匹牵入活动场，让其自由活动，随后统一安排训练。对所选马匹进行为期30 d试验，其中在第0 d、第10 d、第20 d和第30 d进行1 000 m速度测试赛，并于测试赛结束后即刻采集静脉血样本2管。

1.2.2 测定指标

将其中一管血液样本通过H/P/cosmos便携式血乳酸分析仪测定血液样本中血乳酸(LAC)含量。另一管血液样本静置后，使用离心机进行3 500 r/min 离心15 min分离血清，分离后将血清置于-20℃保存待测。采用日立全自动生化仪(7600)测定钙离子(Ca2+)与钾离子(K+)、谷丙转氨酶(ALT)与谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸(LAC)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、补体C3(C3) 补体C4(C4)。

1.3 数据处理

使用Excel软件对试验测定结果进行数据整理，运用SPSS 21.0软件对测定数据进行双因素方差分析，结果以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 饲喂时间对疲劳和免疫的影响

研究表明，K+浓度在饲喂第20 d时显著低于第0 d(P<0.05)，与第30 d时差异不显著(P>0.05)；第0 d、第10 d和第30 d两两间差异均不显著(P>0.05)。Ca2+浓度在饲喂第30 d时显著低于第0 d、第10 d和第20 d(P<0.05)，但第0 d、第10 d和第20 d两两间差异均不显著(P>0.05)。AST活性和ALT活性在饲喂第30 d时显著高于第0 d(P<0.05)，与第10 d和第20 d之间差异均不显著(P>0.05)，第10 d和第20 d时均与第0 d差异不显著(P>0.05)。CK活性在饲喂第30 d时极显著高于第0 d、第10 d和第20 d(P<0.01)，第0 d、第10 d和第20 d两两间差异均不显著(P>0.05)。CK-MB活性在第30 d时极显著高于第10 d(P<0.01)，显著高于第0 d(P<0.05)；第10 d时和第0 d时差异不显著(P>0.05)，第20 d时与其余各组间差异均不显著(P>0.05)。LDH活性在第30 d时极显著高于第10 d(P<0.01)；第10 d时显著低于第0 d时(P<0.05)；第20 d时与其余各组间差异均不显著(P>0.05)。LAC浓度在饲喂第10 d时显著低于第0 d时(P<0.05)，第20 d和第30 d均与第0 d之间差异不显著(P>0.05)。表1

表1 血浆中电解质及生化指标随时间变化
Table 1 Changes of electrolytes and biochemical parameters in plasma over time

0(d)10(d)20(d)30(d)K+ (mmol/L)6.11±1.14a6.31±2.54a4.51±0.89b5.24±1.79abCa2+ (mmol/L)3.12±0.11a3.13±0.14a3.14±0.20a2.99±0.11bAST (IU/L)442.07±94.16b493.45±169.54ab508.91±175.91ab671.33±346.80aALT (IU/L)17.67±4.45b18.64±5.20ab17.82±6.01ab24.92±14.13aCK (U/L)321.20±110.14B301.91±116.18B378.64±153.23B604.67±317.14ACK-MB (U/L)340.93±77.76ABb294.73±73.12Bb352±62.57ABab408.08±86.54AaLDH ( U/L)488.27±102.78ABa416.36±65.98Bb442.91±64.02ABab505.75±72.70AaLAC (mmol/L)19.89±1.89a16.72±5.52b19.11±1.98ab18.55±2.55ab

注：同行不同大写字母表示极显著差异，P<0.01；同行不同小写字母表示显著差异，P<0.05。下同

Note:Different capital letters in one row extremely significant differences (P<0.01),different lowercase letters show significant differences (P<0.05). The same as below

根据不同饲喂时间分组，免疫指标分析结果表明，IgM、IgG、C3和C4在补饲不同阶段差异性不显著(P>0.05)。表2

表2 血浆中免疫指标随时间变化
Table 2 Changes of immune index in plasma over time

0(d)10(d)20(d)30(d)IgM (g/L)0.57±0.180.60±0.210.53±0.200.56±0.17C4 (g/L)0.033±0.0120.032±0.0120.032±0.0090.030±0.010IgG (g/L)8.15±0.608.16±0.658.13±0.508.06±0.65C3 (g/L)0.18±0.020.17±0.020.19±0.030.19±0.03

2.2 饲喂剂量对疲劳和免疫的影响

研究表明，K+浓度随着添加量的增加有略微的波动，在添加300 mg/kg时达到最高值，但各组间差异不显著(P>0.05)。Ca2+浓度随着大蒜素添加量的增加出现了一定的降低现象，差异不显著(P>0.05)。AST活性在添加500 mg/kg时显著高于添加100 mg/kg时(P<0.05)，添加300 mg/kg和0 mg/kg时与添加100 mg/kg和500 mg/kg时差异均不显著(P>0.05)。ALT活性在添加500 mg/kg时最高，但各剂量组中差异不显著(P>0.05)。CK活性在添加100 mg/kg时显著低于对照组(P<0.05)，添加300 mg/kg和添加500 mg/kg时与其余各组间差异不显著(P>0.05)。CK-MB活性在添加300 mg/kg时极显著低于对照组(P<0.01)，添加500 mg/kg时显著低于对照组(P<0.05)，添加100 mg/kg时与对照组之间差异不显著(P>0.05)。LDH活性在添加500 mg/kg时极显著高于对照组(P<0.01)，添加300 mg/kg时显著高于对照组(P<0.05)，添加100 mg/kg时与对照组之间差异不显著(P>0.05)。LAC活性在对照组略微高于其他剂量组，但差异不显著(P>0.05)，且乳酸值在100 mg/kg组，300 mg/kg组与500 mg/kg组相互之间差异不显著(P>0.05)。表3

研究表明免疫球蛋白M浓度在添加100、300和500 mg/kg时均极显著高于对照组(P<0.01)，但各组间差异两两间均不显著(P>0.05)。补体C4浓度在添加300 mg/kg时极显著高于添加100 mg/kg时和对照组(P<0.01)，显著高于添加500 mg/kg(P<0.05)，添加100、500 mg/kg和对照组两两间差异均不显著(P>0.05)。免疫球蛋白G和补体C3浓度随着大蒜素的增加呈现一定的波动，但各组间差异不显著(P>0.05)。表4

表3 血浆中电解质及生化指标变化随补饲浓度变化
Table 3 Changes of electrolyte and biochemical index in plasma with the change of supplementary feeding concentration

0 mg/kg100 mg/kg300 mg/kg500 mg/kgK+ (mmol/L)5.32±0.955.49±1.816.28±2.585.28±1.31Ca2+ (mmol/L)3.17±0.183.07±0.143.09±0.103.08±0.16AST (IU/L )582.9±300.19ab411.25±85.03b517.91±196.20ab633.92±257.61aALT (IU/L)19.80±10.2019.00±5.9716.45±4.3423.50±12.02CK (U/L)511.5±350.82a348.44±96.18b383.09±247.15ab388.00±171.52abCK-MB (U/L)407.80±85.20Aa358.00±94.51ABab313.91±76.70Bb322.17±41.38ABbLDH (U/L)406.80±55.62Bb456.06±79.87ABab481.27±99.79ABa515.50±72.75AaLAC (mmol/L)20.14±1.5918.17±4.8218.72±2.0818.08±2.79

表4 血浆中免疫指标随补饲浓度的变化
Table 4 changes of immune index in plasma with supplementary feeding concentration

0 mg/kg100 mg/kg300 mg/kg500 mg/kgIgM (g/L)0.37±0.05B0.57±0.20A0.58±0.08A0.69±0.18AC4 (g/L)0.029±0.006Bb0.029±0.011Bb0.043±0.005Aa0.033±0.008ABbIgG (g/L)8.17±0.368.32±0.718.12±0.417.84±0.64C3 (g/L)0.18±0.020.19±0.020.18±0.020.18±0.04

3 讨 论

3.1 饲喂时间对疲劳和免疫的影响

疲劳的产生机制比较复杂，其涉及到神经-内分泌-免疫网络的功能协调，是一个周而复始的循环链式反应，其中每一个环节都有可能严重影响到疲劳的发生和疲劳的程度，测定运动后K+、Ca2+浓度水平可用于评价动物机体的损伤程度与疲劳程度[8]，K+通道是心脏电位活动中比较重要的离子通道之一，构成心肌细胞静息电位和动作电位复极的主要离子流，大蒜素可能阻滞心房肌细胞上的超极化激活的延迟整流钾电流，并且大蒜素的抗氧化作用也能减轻细胞内钙离子超载情况，缓解与钙离子超载相关的缺血再灌注损伤，从而能够抑制大强度运动后K+、Ca2+大量渗透到细胞外的现象[9]，试验结果与其研究类似。

ALT与AST广泛分布在动物肌细胞和肝细胞内，在正常情况下血清中ALT与AST含量稳定于一定水平。有研究证实，短跑运动员在不同强度运动训练下，血清AST、ALT的活性均有所增强[10]。刘敏等[11,12]研究发现，日粮添加大蒜素干粉，可以使哈萨克羊血清中AST、ALT检测值呈现显著性升高，但在正常范围之内，未对肝脏与肌肉等组织造成较大损伤。在补饲大蒜素后，血清AST、ALT均有所增加。

LDH对机体在缺氧状态下运动时能量的产生、供应以及乳酸代谢都有着十分重要的意义，所以LDH浓度高低可用来评价肌肉组织的无氧代谢能力，作为无氧氧化的标志酶[13]。金宏等[14]研究，在对大鼠进行游泳训练后，发现大鼠在运动后 LDH浓度明显上升，试验随着正常训练LDH浓度逐渐增高与前人研究相符。LAC被作为判断疲劳程度的重要指标之一[15]，用于评价运动马的运动性能[16]。LAC主要是由剧烈活动的骨骼肌细胞产生，弥散出胞膜后在体液中被稀释转运到体内其他部位进行代谢。LAC作为体液的一部分，其浓度值取决于肌纤维细胞产生LAC的速度，同时还取决于LAC的弥散情况及糖异生转换的速度等。李玉娟等[17]研究表明在缺氧状态情况下，加用一定量的大蒜素干预后，乏氧状态得到明显改善，大蒜素有改善细胞缺氧状态的作用，长时间的大蒜素补饲有助于降低赛后LAC浓度，增强无氧代谢能力，试验结果与其一致。试验结果显示免疫指标变化不大，大蒜素的累积效应在试验中表现不明显。

3.2 饲喂剂量对疲劳和免疫的影响

以不同饲喂剂量分组时，血浆中各指标变化明显，CK具有一定代表性，CK 参与线粒体呼吸、糖酵解的控制和肌肉收缩供能。通过训练运动强度增加，肌纤维收缩时产生的牵拉力变大，使细胞膜的通透性增强，致使更多酶分子进入血液，会出现CK浓度升高的现象[18]。CK在不同组织中有不同的表达，共可分为CK-MM、CK-MB、CK-BB三种亚型，其中在骨骼肌中超过95%是CK-MM形式，其组织特异性能可以准确地反映骨骼肌细胞的损伤情况和机能状态。有研究发现，大蒜素可以减轻离心运动造成的骨骼肌超微结构的损伤，保护细胞膜的通透性和完整性[19]。在大蒜素对心肌细胞微损伤的研究中，CK、CK-MB 水平降低，说明大蒜素对心肌微损伤有一定的保护作用[20]，试验结果与前人研究一致。免疫蛋白是衡量机体免疫功能强弱的重要指标，在一定范围内血清中的球蛋白含量越高，可以反映出动物机体的抗病能力越强。血清中的球蛋白来源于B细胞，是机体内抗体的主要表现形式和物质基础，在机体的体液免疫过程中起主导作用，饲喂大蒜素能够极显著提高免疫球蛋白M的含量[21]，试验结果与其基本一致。补体C4是补体系统经典途径中的主要成分，它在机体防御过程中可以清除病原微生物，并通过活化炎性细胞对靶细胞的杀伤作用来提高机体的免疫机能。黄旭雄等[22]研究发现补饲大蒜素对水产动物的补体C4有显著的促进作用。唐玲[23]在植物添加剂对镜鲤作用的研究中发现，0.5%大蒜茎粉能显著提高血清C4活性，试验结果显示，饲喂大剂量组大蒜素饲料后，血清C4活性较对照组显著增加，与前人研究结果相近。试验表明大蒜素补饲剂量较高的试验组可以通过提高AST和LDH，降低CK和CK-MB来实现抗疲劳作用，并且高剂量组可以通过提高免疫球蛋白M和补体C4来增强机体的免疫力。添加300～500 mg/kg大蒜素可以有效提升马匹抗疲劳能力和机体免疫力。

4 结 论

试验通过对伊犁马进行为期30 d的大蒜素补饲，对伊犁马运动后即刻血液生化指标及免疫指标分析发现，以大蒜素补饲时间分组，随着补饲时间的推进，测试赛赛后即刻血浆Ca2+、k+，乳酸出现降低现象，AST、ALT、LDH存在阶段性上升趋势，说明大蒜素的补饲时间长度对伊犁马抗疲劳作用效果更明显。

以大蒜素补饲量分组，随着补饲量的增加，测试赛后即刻血浆AST、LDH出现升高趋势，CK、CK-MB呈现下降趋势，说明大蒜素的补饲量对伊犁马抗疲劳作用效果明显。免疫指标免疫球蛋白M、补体C4随着补饲量的增加呈现明显的升高趋势，说明补饲剂量是大蒜素对伊犁马免疫作用的主导因素。伊犁马合理的大蒜素补饲量建议控制在300～500 mg/kg，对增强马匹免疫力和改善马匹抗疲劳能力效果良好。