长非编码RNA H19在结直肠癌化疗敏感性中的作用研究

王秀梅 赵海平 秦琼 刘永强 张兵 武永胜

结直肠癌是发病率较高的肠癌之一，据研究调查显示，男性结直肠癌发病占恶性肿瘤发病率第三位、女性结直肠癌发病率居第二位。同其它恶性肿瘤一样，结直肠癌发生和发展是环境和基因交互作用的结果，确切发生机制目前未完全阐明，研究显示，大部分早期结直肠癌患者能通过手术治愈，但患者早期不易发现症状，出现症状时往往已被诊断为结肠癌晚期，导致化疗效果较差，其预后情况不尽人意［1-3］。但有效的分子标记物缺乏及放化疗带来的副作用，致使化疗效果并不理。长链非编码RNA（lncRNA）是200 bp以上且不能翻译成蛋白质的RNA［4-5］，虽不能编码蛋白质，但lncRNA具有诸多生物学作用如调控基因转录、修饰组蛋白等，在细胞核和细胞质中广泛分布。随着基因芯片等技术的应用，发现越来越多的lncRNA与结直肠癌发生和发展存在密切联系，在结直肠癌的作用机制逐渐清晰［6］。目前仍不清楚lncRNA 对结直肠癌的化疗效果影响［7］，H19 基因位于人染色体11p15.5，调控细胞生长等过程，研究表明 H19 在结直肠癌中可能具有癌基因和抑癌基因的双重作用［8-9］。但目前尚未有资料研究H19基因对结直肠癌化疗敏感性的影响。本研究拟探讨H19基因调控结直肠癌化疗敏感性机制。

资料和方法

一、主要材料和试剂

人结肠癌细胞系LoVo来自于中科院上海细胞所。RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）购自GIBCO 公司；转染试剂脂质体2000购自Introgen（美国）公司；lncRNA H19 引物由上海生工生物合成。MDR1、MRP1、BCRP、bcl-2、bax等抗体均购自CST公司。选取2017年1～12月本院肿瘤科26例结直肠癌组织及相应癌旁组织，患者年龄43～78 岁，平均（63.65±14.17）岁，其中男 15 例，女11 例。标本全部经专业病理科人员指导采集并经病理切片证实。

二、方法

（一）细胞培养及转染

在 RPMI1640培养液，于37 ℃、5% CO2、90% 湿度孵箱中贴壁培养结直肠癌细胞LoVo。根

据脂质体2000操作说明，将脂质体2000分别将H19siRNA、pcDNA-H19质粒及阴性对照载体转染至LoVo细胞，构建lncRNA H19稳定过表达及表达沉默的结肠癌细胞株。

（二）MTT法检测各组细胞对5-FU敏感性

各组分别加100 μL细胞至96孔板中。 每组加入5-Fu使终浓度分别为1、2、4、8、16、32、64、132 g/mL，各组细胞各个浓度设3个重复。5%CO2孵箱中培养48 h后，每孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL）工作液，继续培养4 h弃去培养液，再加入150 μL二甲基亚砜，震荡10 min，于自动酶标仪测定各孔450 nm处吸光度值。根据公式：抑制率=（1－实验组平均 A值/对照组平均A 值）×100%，根据抑制率计算得到半数抑制浓度（IC50值）。

（三）划痕实验

细胞培养至细胞密度达到85%时，在培养孔垂直方向用枪头轻轻划过贴壁细胞层。用PBS洗去脱落细胞后继续培养，分别于0 h、48 h时在显微镜下对划痕拍摄，计算距离。

（四）RT-qPCR检测lncRNA H19表达

Trizol法提取细胞总RNA。用TaqMan@MicroRNA Reverse Transcription kit进行反转录，反 应 总 体 系 为 10 μL。 用 TaqMan@MicroRNA Assays Realtime PCR试 剂 盒 检 测lncRNA H19表达，以β-actin作为内标，lncRNA H19 F：5’-GGCAAGAAGCGGGTCTGT-3’；R：5’-GTGCAGCATATTCATTTCCAAG-3’；β -actin F：5’- CCTGTACGCCAACACAGTGC - 3’；β-actin R：5’- ATACTCCT GCTTGCTGATCC -3’； 每组设三个重复，根据△△CT法对结果进行相对定量分析，根据各样本的平均Ct 值，以 2-ΔΔCt表示mRNA相对表达水平，所有反应均在ABI7500实时定量PCR仪完成。

（五）Western blot

根据蛋白提取试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白总量。根据目的蛋白分子量，用合适浓度的SDS-PAGE凝胶电泳分离，继而转膜和封闭，稀释一抗后放置在4 ℃冰箱过夜；用TBST洗涤3次，二抗孵育60 min后继续TBST洗涤3次，化学发光后采集图像。

三、统计学分析

经SPSS l9.0统计学软件统计和分析数据，计量资料用平均数±标准差（）表示，用t检验计算两组间差异，单因素方差分析计算多组间差异，P＜0.05表示差异有显著统计学意义。

结 果

一、结直肠癌中lncRNA H19表达情况

采用实时荧光定量PCR方法检测26例结直肠癌及对应的旁癌正常组织标本中lncRNA H19的表达水平。与旁癌组织相比，结直肠癌组织中lncRNA H19的相对表达量显著增加（P＜0.05）。见图1。

图1 lncRNA H19在结直肠癌组织中高表达

二、lncRNA H19转染效果

qRT-PCR检测结果显示，H19siRNA转染后lncRNA H19表达显著降低（P＜0.05），pcDNA-H19质粒转染后lncRNA H19表达显著上调（P＜0.05），空白对照无明显变化。提示转染效果良好，可用于后续实验。见图2。

三、结肠癌细胞株LoVo对5 -FU的化疗敏感性差异

MTT实验结果显示，空白对照组LoVo细胞IC50为（52.31±4.32）μg/mL， 过 表 达 lncRNA H19后，IC50为（98.32±9.32）μg/mL， 提 示lncRNA H19上调可导致LoVo对5-FU的敏感性降低。干扰lncRNA H19 LoVo IC50为（31.21±2.12）μg/mL，提示lncRNA H19下调可导致LoVo对5-FU的敏感性增加。见图3。

四、细胞迁移能力

图2 lncRNA H19转染

图3 结肠癌细胞株LoVo对5-FU的化疗敏感性

划痕后48 h时，H19过表达后LoVo细胞的划痕距离比阴性对照组（negative control，NC）大，差异具有显著性统计学意义（t=4.542，P＜0.01）。H19干扰后LoVo细胞的划痕距离比NC细胞小，差异具有显著性统计意义（t=5.613，P＜0.01），见图4。

五、Western blot检测凋亡及耐药蛋白水平

Western blotting 检测不同转染细胞后对凋亡蛋白BCL-2、Bax；耐药蛋白MDR1、MRP1和BCRP表达，结果显示H19过表达后LoVo细胞Bax蛋白表达下调，BCL-2、MDR1、MRP1和BCRP蛋白表达上调，H19干扰后Bax蛋白表达上调，BCL-2、MDR1、MRP1和BCRP蛋白表达下调，见图5。

讨 论

近期诸多研究证实，多种LncRNA在结直肠癌的发生、发展中扮演重要角色［10］。目前发现结直肠癌相关的主要LncRNA主要有H19、结肠癌相关转录物1、肺腺癌转移相关转录本1、UCA1等。H19通过miRNA675和靶向蛋白质发挥作用［11-13］。5-FU作为结肠癌患者的一线化疗用药，其毒性较低，且抗肿瘤活性持续时间较长［14-16］。但随着持续用药，患者对5-FU逐渐产生耐药性，化疗药物逐渐变得无效。深入研究H19表达对结肠癌患者耐药的调控机制，可能为提高临床疗效提供支持［17］。

图4 各组细胞迁移水平

图5 蛋白表达印迹图

本研究采用RT-PCR 的方法检测26对结直肠癌组织及旁癌组织中lncRNA H19的表达，结果显示lncRNA H19在结直肠癌组织中明显上调（P＜0.05），与以往文献研究结果一致［18］，为了进一步研究lncRNA H19对结直肠癌化疗敏感性影响，本研究构建lncRNA H19干扰、过表达其空载对照的结肠癌细胞稳定株。通过RT-qPCR检测转染效果，干扰后和过表达LoVo细胞的lncRNA H19表达水平分别为相应对照组的0.45倍和1.54倍，提示转染成功，可用于后续实验，继续用MTT实验检测不同处理后结直肠癌细胞的增殖，结果显示过表达lncRNA H19后，LoVo细胞敏感性下降，而干扰lncRNA H19，敏感性增加，提示下调lncRNA H19可提高结直肠癌对5-FU的化疗敏感性。用划痕实验检测不同处理后肿瘤细胞迁移情况，发现H19表达下调能有效抑制LoVo细胞的迁移，为了进一步探讨lncRNA H19对结直肠癌耐药调控机制，本研究检测不同处理后肿瘤细胞在5-FU培养中凋亡蛋白影响，结果显示H19过表达后LoVo细胞Bax蛋白表达下调，BCL-2蛋白表达上调，H19干扰后Bax蛋白表达上调，BCL-2蛋白表达下调，提示干扰H19可以促进肿瘤细胞凋亡来影响细胞增殖和迁移，本研究继续检测细胞耐药蛋白MDR1、MRP1和BCRP表达情况，结果发现干扰H19后MDR1、MRP1和BCRP者三类耐药蛋白明显下调，而过表达H19 MDR1、MRP1和BCRP者三类耐药蛋白明显上调，提示干扰H19提升化疗敏感性可能与下调耐药蛋白相关。

综上所述，在结直肠癌中H19表达明显增加，干扰H19后可明显抑制细胞增殖和迁移和促进凋亡，提高5- FU敏感性，下调耐药蛋白表达。但其在体内与体外的作用是否一致，还有待进一步研究，是潜在的结直肠癌治疗靶点。