蜂胶中总黄酮的提取与紫外可见分光光度计的测定

梁凤珍

摘 要：蜂胶是蜜蜂从植物的树芽、树皮等部位采集的树脂，再混以蜜蜂舌腺、蜡腺等腺体的分泌物，经蜜蜂加工转化而成的一种胶状物质。蜂胶中含有大量的黄酮类化合物。黄酮类化合物有很好的药用价值，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、消炎镇痛、防腐保鲜等多种功效，能增加机体免疫力，促进组织再生，已越来越广泛地应用于医药、食品、化妆品等领域。近年来已有很多学者研究了从蜂胶中提取黄酮类化合物的工艺方法，提出了很多新型的、较优的提取工艺方法;并研究了很多黄酮类化合物的测定方法。本文采用最常用最简单的分析方法-紫外可见分光光度法，在相关文献的基础上对蜂胶中总黄酮的提取与测定进行研究，研究了提取条件（提取方式、提取时间，提取剂浓度）对蜂胶中总黄酮的提取率的影响;研究了参比溶液的选择以及显色剂的选用、酸度、显色时间对测定结果的影响。通过紫外分光光度法，对蜂胶中的总黄酮进行测定，建立的线性回归方程线性良好，R2=0.9999;线性范围宽，0～20μg/mL;回收率102.4%;检出限0.162μg/mL。实验结果表明，紫外可见分光光度法简单可行，准确度高，相对标准偏差小，检出限低，是测定蜂胶提取物中总黄酮含量的一种经济有效的方法。

关键词：蜂胶;总黄酮;提取;测定;紫外可见分光光度

1 实验部分

1.1 实验原理

蜂胶中主要含有黄酮类和黄酮醇化合物，利用3、5位有羟基的黄酮与Al+可生成螯合物，显黄色，在最大吸收峰波长415nm左右处测定其吸光度。在415nm左右范围内，其吸光度与黄酮类化合物的含量成正比。以芦丁为对照品，建立标准曲线，定量测试黄酮类化合物的含量。

1.2 实验仪器和实验试剂

1.2.1 实验仪器

UV-2102 PCS型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司;AL104电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2.2 实验试剂的配制

①0.1mol/L AlCl3：称取1.21g AlCl3·6H2O于小烧杯中加水溶解，转移到50mL容量瓶中，加水到刻度，摇匀;

②200μg/mL芦丁储备液：准确称取0.0100g芦丁与小烧杯中加无水乙醇溶解，转移到50mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀;

③95%乙醇：量取95mL无水乙醇至250mL烧杯中，加5mL水，混匀。

1.3 实验操作步骤

1.3.1 样品处理

去掉蜂胶胶囊外层的胶囊皮，准确称取胶囊里层的粉末，置于小烧杯中，加95%乙醇30mL，用玻璃棒在室温下不断搅拌5min，转移至100mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，摇匀。过滤，弃去开始滤液，去中间滤液若干毫升待测。

1.3.2 标准曲线的绘制

精密吸取芦丁储备液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL分别置于10mL容量瓶中，加无水乙醇至总体积为4mL，再加入0.1mol/L AlCl3 溶液1.00mL，加水至刻度，摇匀。静置30min。以40%乙醇溶液为参比，在350nm～500nm进行扫描，在最大吸收峰波长处，测定其吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。

1.3.3 样品空白的制备

精确吸取1.00mL样品溶液置于10mL容量瓶中，加无水乙醇至总体积为4mL，加水至刻度，摇匀。

1.3.4 样品测定

精确吸取1.00mL样品溶液置于10mL容量瓶中，加无水乙醇至总体积为4mL，再加入0.1mol/L AlCl3 溶液1.00mL，加水至刻度，摇匀。静置30min。以样品空白为参比，在与标准曲线相同的测试波长处，测定其样品的吸光度。通过标准曲线回归计算其样品中总黄酮的浓度，从而计算样品中总黄酮含量。

1.4 计算样品中总黄酮的含量

X=C*10/1*100/m*/1000，式中：X：样品中总黄酮的含量，单位mg/g;C：由标准曲线回归方程，计算得到的样品中总黄酮的浓度，单位μg/mL;m：样品的质量，单位g。

2 结果与讨论

2.1 蜂胶中黄酮类化合物的提取

2.1.1 提取方式

准确称取三份样品，用95%乙醇提取剂分别用普通65℃水浴回流30min、超声波65℃水浴回流30min、室温下搅拌5min三种提取方式提取。实验结果如表3-1。从表中实验结果可以看出，不同的提取方式对提取样品中黄酮类化合物的含量几乎没有影响。

2.1.2 提取时间

准确称取三份样品，用95%乙醇提取剂，用超声波在65℃水浴下分别回流10min、30min、60min。实验结果如表3-2。从表中实验结果可以看出，提取时间对提取样品中黄酮类化合物的含量几乎没有影响。

2.1.3 乙醇提取剂的浓度

准确称取五份样品，分别用60%、70%、80%、95%、无水乙醇提取剂，在室温下搅拌5min提取。实验结果如表3-3。在实验过程中，加入不同浓度的乙醇提取剂后，发现用60%、70%乙醇的样品溶解程度很差，在溶液上层有很多悬浮物，且溶液呈灰色;而用80%、95%、无水乙醇提取剂的样品溶解程度很好，在溶液上层没有悬浮物，溶液呈黄色。从表中实验结果可以看出，用60%、70%乙醇提取样品中总黄酮的含量很低，而用95%乙醇提取样品中总黄酮的含量效果较好。根据本实验研究，根据本实验原料的特点，选用最简便、最省时、提取效果较优的方法，即用95%乙醇作提取剂，在室温下用玻璃棒搅拌5min来提取蜂胶样品中的总黄酮。

2.2 显色剂的选择

选用不同的显色剂体系，溶液的pH值也不同，使得溶液的最大吸收峰波长不同，测得的溶液吸光度也不同，如表3-4。表中畫“-”格表示样品溶液在400～650nm吸收峰型不明显，没有测其吸光度和溶液pH值，而显色剂为亚硝酸钠+硝酸铝+氢氧化钠时，芦丁溶液的吸光度很小，可能是大部分黄酮类化合物不显色所致。有时候芦丁溶液在400～650nm处波长扫描，最大吸收峰峰型也不明显，可能是黄酮分子在碱性条件下，与Al3+ 形成的红色络合物性质不稳定，随着时间的推移会很快褪色，影响测定结果;且蜂胶中黄酮在亚硝酸钠+硝酸铝+氢氧化钠显色体系下，只有少数的黄烷醇类或具有糖结构的黄酮可以在这个显色体系下显红色，而部分多羟基黄酮在这个显色体系下不能显色、显黄色或者微弱的红色，很多不是黄酮类的物质在这体系下也会显色，使得测得的总黄酮的含量偏差很大，所以不选用显色剂为亚硝酸钠+硝酸铝+氢氧化钠。从表中数据可以看出，芦丁溶液在pH值大时吸光度大，而样品溶液在pH值大时吸光度小;显色剂为硝酸铝时，芦丁溶液的最大吸收峰波长和样品溶液的最大吸收峰波长相差甚远。选用使得芦丁溶液的最大吸收峰波长和样品溶液的最大吸收峰波长相近，且两者的吸光度较大的显色剂，所以选用氯化铝作显色剂。选用氯化铝作显色剂是在酸性条件下测定，避免了Al3+在碱性条件下产生沉淀，影响测定结果。

2.3 参比溶液的选择

由于对照品芦丁比较纯净，无干扰，且显色剂又为无色，所以选用溶剂做参比，即用40%乙醇做参比。当然用试剂参比也是可以的，用40%乙醇作参比时，试剂空白也几乎没有吸收，所以用试剂空白作参比影响也不大。由于样品比较复杂，且含有有色离子，如果使用溶剂参比，会有干扰，使吸收曲线峰型不明显，所以选用样品参比。

2.4 标准曲线绘制及其线性范围

精密吸取芦丁储备液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL分别置于10mL容量瓶中，加无水乙醇至总体积为4mL，再加入0.1mol/L AlCl3 溶液1.00mL，加水至刻度，摇匀。静置30min。以40%乙醇溶液为参比，在350nm～500nm进行波长扫描，测得其最大吸收峰波长为413nm，在最大吸收峰波长处，测定其吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线线性回归方程，如表3-5。

得到标准曲线线性回归方程为y=0.0268x-0.001，相关系数为0.9999，线性范围为0～20μg/mL。表明本方法在该浓度范围内有良好的线性关系。

2.5 加标回收率

为了验证实验所测得结果的准确性，做加标回收率实验来说明。吸取样品溶液0.50mL于6个10mL容量瓶中，分别加入芦丁储备液0.00mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL，加入无水乙醇至总体积为4mL，再加入0.1mol/L AlCl3 溶液1.00mL，加水至刻度，摇匀。静置30min。以样品空白为参比，在与标准曲线相同的测试波长处，测定其样品的吸光度。实验结果如表3-6。

2.6 检出限

检出限指的是可检出样品中某元素的最小量。因此检出限是衡量一个方法好坏的重要技术指标之一。

本次实验的检出限由下式求得：DL=3×SD/K

其中SD为标准偏差，即连续10次测量试剂空白溶液（即标准曲线的绘制中加0.00mL芦丁的溶液）的吸光度的标准偏差;K为标准曲线的斜率。实验结果如表3-7、表3-8。

3 結论

本文用95%乙醇作为浸取剂，对蜂胶中黄酮类化合物进行提取是可行的，提取率也是比较高的，仪器简单，操作简便，省时。通过紫外分光光度法，对蜂胶中的总黄酮进行测定，建立的线性回归方程线性良好，R2=0.9999;线性范围宽，0～20μg/mL;加标回收率102.4%;检出限0.162μg/mL。实验结果表明，紫外可见分光光度法简单可行，准确度高，相对标准偏差小，检出限低，是测定蜂胶提取物中总黄酮含量的一种经济有效的方法。

参考文献：

[1]张利，戴晶晶，曾凡骏.蜂胶总黄酮的提取最佳工艺研究[J].四川食品与发酵，2008（44）：4.

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