高通量测序技术在肿瘤临床上的应用

孙吉 张坤驰

摘 要：随着高通量测序技术的日渐成熟，技术原理和材料工程不断创新，基础科研在临床诊疗中的应用日趋广泛，NGS在癌症基因组学研究领域中的应用越来越广泛。最近，NGS已被用于临床肿瘤学以促进癌症的个体化治疗。本文列举了高通量测序技术在临床上的肿瘤诊断、治疗及预后方面的主要指导作用，并展望了其在肿瘤领域的应用前景。

关键词：高通量测序；肿瘤；诊治；预后

1 NGS的简介

高通量测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）是近年来发展成熟的一项前沿技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。[1] NGS是对传统测序一次革命性的改变，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，通常包括样本前处理、测序文库构建、数据分析解读等，所以也被称为深度测序（Deep Sequencing）。[2]

2 NGS的主要平台

测序技术包括多种方法，基本的原理都是在DNA 进行PCR 扩增时，借助一些化学标志物在碱基插入DNA 链时发出的信号来读取序列信息。大体上它们可被组合为模板制备、测序和成像以及数据分析，可以通过特定方法的独特组合将不同的平台区分开，并从每个平台产生的数据确定其种类。而各平台有其不同的原理、优点及局限性，如Illumina/Solexa 平臺应用可逆链终止物和合成测序法，其价格低廉且通量高数据量大，局限是仪器和用于分析的费用高昂；Life/Solid平台应用连接测序法，准确度高、成本低，不过读长短、测序时间长；Roche/454平台应用焦磷酸测序法，准确度达99%以上，在第二代中具有最高读长并且比第一代的测序通量大，但无法测量同聚物的长度；Ion Torrent平台应用半导体技术，直接在化学和数学信息之间建立联系，具有低成本、快速并准确的优点。[3]

3 NGS在临床肿瘤诊断、治疗及预后方面的应用

3.1 在乳腺癌和卵巢癌方面的应用

NGS用于24个三阴性乳腺癌（TNBC）与14个临近正常组织获得的公开可用的小RNA测序数据，重绘不同类型的sncRNAs，发现TNBC中有55个miRNA异常表达，结果多于继往的研究，为于TNBC的诊断开发了新的工具；有研究将NGS平台用于临床难治疗的转移性乳腺癌（mBC），将315个外显子和28个难治性mBC基因的选择性内含子测序，使用这种定向的NGS选定分析潜在的可控转变来描述晚期癌症患者的突变，该实验分析为35%的临床患者提供了帮助；有研究调查了287名连续不相关的意大利妇女受乳腺癌或卵巢癌的影响，利用可靠的拷贝数变异（CNV）预测算法进行NGS输送，所有样品用多重扩增子定量（MAQ）分析，而多重连接依赖探针扩增（MLPA）技术作为可能的替代方法，结果表明BRCA1/2基因的重新排列的prevalence是患者中检测到的所有治病突变的12%，MAQ的结果显示假阳性结果的2.8%，这种基于NGS的方法完全可以满足BRCA1/2 LGRs检测的灵敏性和特异性需求，这种方式是非常易于使用的BRCA1/2筛查方法，并较易在门诊检验中使用。[4]

3.2 在癌症免疫治疗上的应用

肿瘤基因突变对肿瘤的发生发展起有很大影响。2012发现的T细胞依赖的癌症进展机制，使得癌症与免疫治疗具备潜在关联。NGS可以应用于个体化肿瘤临床治疗，可包括个体化的剂量、疫苗开发、基因突变的对症治疗。比如，肿瘤活性淋巴细胞的新抗原和有效迁移的连续识别，促进免疫治疗的发展。[5]

近年来，计算机分析能力的开发，NGS数据可有效分析肿瘤-免疫细胞相互作用，如Tlminer方法可以整合免疫原分析，包括：人类白细胞抗原分型、新抗原预测、免疫浸润特征和肿瘤免疫原性的定量，[6]从小基因集中准确预测个体肿瘤的总突变量（PTML），这种方法已经被应用于指导靶向治疗。

4 结论

NGS具有许多优点，检测速度快、准确率高、成本低 、覆盖面广以及产出巨大等特点，[7]能够在一个单一的测试中以相对低的成本完全测序所有类型的突变（数百到数千个）的所有类型的突变以及与其他测序方式相比的灵敏度、速度。其中对海量的测序数据进行分析，精准锁定相关突变是NGS的难点，需要进一步的成熟完善。虽然NGS已被用于临床实践，NGS可以提供重要的信息来表征癌症基因组结构的变化，然而，在对疾病全面的认识中，表观遗传变异、肿瘤微环境的贡献和种系遗传变异也需要列入考虑范围。

参考文献：

[1]张文力.高通量测序数据分析现状与挑战.集成技术，2012（3）.

[2]白晶.中药转录组学及IncRNA挖掘的应用研究.中国科技信息，2013（21）.

[3]赵跃.下一代半导体测序技术在遗传性心肌病分子诊断中的应用.遗传，2015（7）.

[4]Concolino P，Rizza R，Mignone F，et al.A comprehensive BRCA1/2 NGS pipeline for an immediate Copy Number Variation （CNV） detection in breast and ovarian cancer molecular diagnosis[J].Clinica Chimica Acta，2018，480.

[5]Siniard R C，Harada S.Immunogenomics：using genomics to personalize cancer immunotherapy[J].Virchows Archiv，2017，471（2）：1-11.

[6]Tappeiner E，Finotello F，Charoentong P，et al.TIminer：NGS data mining pipeline for cancer immunology and immunotherapy[J].Bioinformatics，2017，33（19）.

[7]周莹.二代测序技术在临床医学上的相关应用.昆明医科大学学报，2016（3）.