山西省杜鹃花属植物亲缘关系的RAPD分析

张哲玮，邢国明

（1.晋中市林业局，山西晋中030600；2.山西农业大学，山西太谷030801）

杜鹃花科（Ericaceae）杜鹃花属（RhododendronL.）植物在全球约有960种[1]，许多种类色彩鲜艳，是园艺观赏的重要品种，部分种类的花、叶、根具有药用和工业价值[2]。山西省野生杜鹃花属植物仅有照山白（Rhododendron micranthum）和迎红杜鹃（Rhododendron mucronulatum）[3]，对野生杜鹃的引种选育既可丰富山西省杜鹃花的多样性，还可综合开发带来经济效益。

RAPD（Random amplified polymophic DNA）是由WILLAMS等提出的一种检测DNA多态性的分子标记技术[4]，其特点是所需DNA用量少、对DNA的纯度要求不高、不涉及放射性同位素、程序简单、灵敏度高、多态性丰富[5-7]，在植物种质资源品种鉴别、亲缘关系分析方面应用广泛。

植物育种的关键是正确选择亲本材料，如果亲本的遗传基础狭窄，将难以培育出优良的新品种。杜鹃花属植物种类繁多，相似品种用传统分类学区分困难。因此，分析杜鹃花属植物的亲缘关系，对于杜鹃花的选育具有重要的指导意义。目前，已有学者陆续采用分子标记技术研究杜鹃花的亲缘关系，但大多集中在杜鹃花分布广泛的地区[8-10]，山西省有关杜鹃花的分子标记尚未开展。

本研究运用RAPD技术，分析山西省2种野生杜鹃和6个常见的引进品种的亲缘关系，旨在为山西省杜鹃花的分类鉴定和遗传育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试11份样品采集自山西省不同区域，照山白和迎红杜鹃从野外采集，6个园艺品种分别由晋中市和太原市苗圃提供（表1）。选取植株嫩叶放入硅胶密封干燥，-20℃保存[11-12]。

表1 供试材料及其地理信息

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取及检测 选取一个样品分别采用CTAB法[13]与核沉淀法[14]提取DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量（图1），比较之后确定使用核沉淀法。用微量紫外/可见分光光度计（Nanodrop ND-1000）检测所提DNA的浓度及纯度，并最终稀释成20 ng/μL，4℃保存备用。

1.2.2 引物筛选 随机抽取3个样品的DNA，对50条引物进行筛选，将能扩增出条带的引物进行二次筛选，依据电泳结果，挑选扩增条带清晰、多态性丰富的引物用于杜鹃花的亲缘关系研究。

1.2.3 建立RAPD-PCR体系 PCR扩增程序参照周兰英等[15]的方法，即94℃预变性4 min；94℃变性 30 s，36℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，共 45个循环；最后72℃延伸10 min，产物于4℃保存。

RAPD-PCR反应体系[16]经优化确定为：20μL反应液中包括 2 μL 模版 DNA，0.3 μL Taq DNA 聚合酶（5 U），2 μL 10×buffer（2 mmol/L含Mg2+），1.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1.2 μL 引物 （20 U），13.3 μL ddH2O。

1.2.4 扩增产物检测 扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳，使用自动凝胶成像系统拍照，并记录数据。

1.3 统计分析

根据电泳图上扩增谱带的有无分别赋值，有带记为1，无带记为0，将得到的1-0矩阵用NTSYS软件处理，以Nei-Li公式计算遗传相似系数。

其中，GS为遗传相似系数，Nij为样品i和j共有的扩增片段数，Ni和Nj分别代表样品i，j的扩增片段数目。

按照非加权成对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析[17-19]。

2 结果与分析

2.1 引物筛选结果

从50条引物中选出4条引物（表2），扩增出的条带清晰，重复性和多态性均较好（图2），符合分子标记对扩增条带的要求。

表2 试验筛选出的引物

2.2 扩增产物多态性分析

用筛选出的4条引物对11个供试样品进行RAPD-PCR扩增，由图3，4可知，共扩增出44条DNA条带，其中，多态性条带数28条，多态位点率63.64%，平均每个引物扩增谱带11条，说明杜鹃花属植物在分子水平上多态性是比较丰富的。通过分析，5个亚属中都存在本亚属特有的共有谱带，分别为杜鹃亚属3条、迎红杜鹃亚属2条、马银花亚属2条、羊踯躅亚属1条、映山红亚属3条，扩增结果在一定程度上体现了各亚属的特性。

2.3 亲缘关系分析

表3 8种杜鹃（11个样品）的相似系数

将统计的1-0数据用NTSYS软件处理，计算得出各样品间的遗传相似系数（GS）。由表3可知，11个样本间的GS在0.238 8～0.970 2，平均值为0.540 6，说明各样本间遗传基础差异较大。照山白与迎红杜鹃的GS最小，为0.238 8，说明亲缘关系最远；最大GS为0.970 2，在照山白样本间产生，表明同种杜鹃在不同地域上仍有很高的同源性；刺毛杜鹃与马银花之间的GS为0.850 8，锦绣杜鹃与皋月杜鹃之间的GS为0.880 6，表明同一亚属间的品种亲缘关系较近；迎红杜鹃与羊踯躅为不同亚属，GS却高达0.850 8，表明二者在形态学上虽有一定差异，但遗传背景却有很高的同源性。

2.4 聚类结果分析

用UPGMA方法对8种杜鹃花（11个样品）进行聚类分析，结果如图5所示，11个样品在遗传相似系数（GS）为0.78附近被划分成3大类群，第1类群为3个照山白样品，属杜鹃亚属；第2类群中，迎红杜鹃与羊踯躅、刺毛杜鹃与马银花在GS为0.85处先聚为2组，随后聚为一类；第3类群为满山红、锦绣杜鹃和皋月杜鹃，同属映山红亚属。第2，3类群在GS为0.64处聚类后，在GS为0.33处与第1类群最终聚为一类，聚类结果与形态学分类相吻合。

3 讨论与结论

分子标记技术能快速准确地对植物材料进行鉴别，其中，RAPD，AFLP[20]等技术更便于进行植物的遗传多样性分析。RAPD标记作为以PCR为基础的分子标记，具有所需DNA用量少、对模板DNA的纯度要求不高、不涉及放射性同位素、程序简单、灵敏度高、多态性丰富的优点。本研究应用RAPD标记对试验材料间的亲缘关系进行分析，通过优化PCR反应体系，提高了试验的稳定性和重复性。

本试验使用从50条引物中选出的4条引物，对8种杜鹃花进行扩增，共得到44条清晰条带，其中，多态性条带28条，多态位点率63.64%，4条引物能够较好地将供试材料区分开，表明RAPD标记对杜鹃花的遗传多样性分析是可行的。

用Nei-Li公式计算经NTSYS软件处理的统计数据，得出遗传相似系数（GS）在0.238 8～0.970 2，平均值为0.540 6，表明这8个品种具有较丰富的遗传多样性。UPGMA聚类结果显示，在不同遗传相似系数上，8个品种可分为多个亚属，在GS为0.78附近，11份供试材料划分成3大类群，第1类群的照山白属于杜鹃亚属照山白亚组，与其他样品的GS均在0.42以下，说明与其他品种间的亲缘关系较远，原因可能是照山白的形态和习性与其余供试品种有较大差异；第2类群为迎红杜鹃、羊踯躅、刺毛杜鹃和马银花，分别属于迎红杜鹃亚属、羊踯躅亚属和马银花亚属（刺毛杜鹃、马银花），4个品种在形态学上差异明显，但在基因水平上具有很高的同源性，特别是迎红杜鹃和羊踯躅，不同亚属的GS达到了0.850 8，这与杜鹃花在长期进化过程中基因交流频繁，且属异花授粉植物有关[21]。第3类群为满山红、锦绣杜鹃和皋月杜鹃，同属映山红亚属，表明同一亚属间的品种亲缘关系较近。

杜鹃花的新品种选育一直都是通过形态学分析测试来鉴定和选择亲本，随着分子标记技术的发展，可在分子水平上快速准确的分析亲缘关系，选择出遗传多样性丰富的亲本。本研究运用RAPD技术，对8个品种的杜鹃花进行了亲缘关系分析，试验结果可为山西省杜鹃花的分类鉴定和遗传育种提供分子水平的理论依据。