黄葵胶囊对糖尿病肾病TGF-β1、α-SMA、ILK表达影响的研究

杨筱瑶 王亦薇 施中凯

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是一种常见的糖尿病并发症，其所致的慢性肾功能衰竭是糖尿病患者的主要死因[1-2]。糖尿病肾病的病理特点是肾小球硬化与肾间质纤维化。α-SMA在肾脏的表达水平可以反映肾间质纤维化的严重程度[3]。TGF-β1被认为是重要的促肾间质纤维化因子之一[4]。而ILK参与TGF-β1诱导EMT的重要步骤[5]。因此，探索一种恢复糖尿病肾病肾脏功能，延缓肾脏纤维化的药物十分必要。本研究通过观察黄葵胶囊对糖尿病肾病大鼠生化指标、肾脏结构改变及肾间质纤维化关键因子表达的影响，来探索黄葵胶囊对糖尿病肾病的治疗效果及其作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

45只体重170 g，8周龄左右的SPF级雄性SD（Sprague Dawley）大鼠，购自哈尔滨医科大学动物中心，所有大鼠适应性喂养1周，给予标准饲料，自由饮水。黄葵胶囊（国药准字Z19990040）购自江苏苏中药业集团股份有限公司；STZ购自Sigma公司。

1.2 研究方法

给予SD大鼠高糖、高脂饮食（常规饲料加入20%糖，10%猪油，2.5%胆固醇），均自由饮水，于8周后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液3.5 ml/kg，进行麻醉，之后行左侧肾脏切除术。术后2周禁食18 h后按50 mg/kg一次性给与STZ腹腔注射，72 h后测尾静脉血糖并留24 h尿。以血糖水平＞16.7 mmol/L、尿糖阳性，并稳定5天且2周后测尿蛋白阳性，作为糖尿病肾病模型建立标准。将45只SD大鼠随机分为正常对照组、糖尿病肾病组与黄葵处理组三组，每组15只。在造模成功后，黄葵处理组大鼠每天按0.2 g/kg给予灌胃，正常对照组及糖尿病肾病组也同时给予蒸馏水灌胃1 ml，每天1次，持续8周。于第8周末，用代谢笼收集24 h尿液测定尿蛋白水平，采集血液检测血清肌酐、尿素氮，取肾脏组织进行HE染色，观察并提取RNA检测TGF-β1、α-SMA及ILK的mRNA表达水平。

1.3 评价方法

1.3.1 总RNA提取及qRT-PCR实验 分别取三组动物的肾脏组织50 mg研磨后，用Trizol法提取相关基因总RNA，用紫外分光光度仪检测RNA浓度，进行qRT-PCR。反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火15 s，经40个循环，95℃延伸15 s。以β-actin为内参照，计算相关基因mRNA表达的相对水平，实验重复3次。

1.3.2 生化指标分析 用代谢笼收集24 h尿液，检测尿蛋白。采集大鼠血清后用自动生化仪检测肌酐、尿素氮水平。

1.3.3 HE染色观察肾脏组织病理改变 用4%多聚甲醛固定肾脏组织，并用石蜡包埋，并对病理切片进行HE染色，用光镜观察大鼠肾脏组织的病理改变。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料用（±s）表示，两组间变量用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄葵胶囊对大鼠血清肌酐、尿素氮及蛋白尿的影响

黄葵胶囊可以明显降低大鼠血清肌酐、尿素氮及蛋白尿（表1）。

2.2 大鼠肾脏组织中TGF-β1、α-SMA及ILK mRNA的表达

黄葵胶囊可明显降低TGF-β1、α-SMA及ILK mRNA的表达（图1）。

图1 各组大鼠肾脏组织中TGF-β1、α-SMA及ILK mRNA的表达

2.3 HE染色检测

黄葵胶囊可改善肾小球硬化、系膜增生和肾小球基底膜增厚的情况（图2）。

图2 各组大鼠HE染色比较

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病患者的首要致死因素，给患者造成很大的经济负担，其病理改变主要包括肾脏纤维化，肾小球和肾小管功能障碍，从而导致蛋白尿和肾小球滤过不全[6]。有证据显示TGF-β1在糖尿病肾病患者中有重要作用，在糖尿病肾病中，TGF-β1被认为是肾脏纤维化与肾脏增大的重要调节因子。在STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型中，TGF-β1显著增高，可能对肾小球基底膜增厚、肾小球硬化和胶原蛋白沉积有重要影响[7]。α-SMA在成肌纤维细胞中表达，在糖尿病肾病中α-SMA表达升高可导致细胞外基质累积，从而引起肾小球闭塞。在糖尿病肾病大鼠中诱导α-SMA高表达可促进肾小球硬化的进展。而ILK在糖尿病肾病肾间质纤维化过程中起到十分重要的作用。

表1 各组大鼠肌酐、尿素氮及蛋白尿情况

很多研究表明，传统中药是治疗糖尿病的重要资源，并可以延缓糖尿病肾病等其并发症的发展[8-9]。已经确认黄葵胶囊在很多慢性肾脏疾病都有减轻血尿，蛋白尿，改善肾功能的作用[10-12]。然而，黄葵胶囊治疗糖尿病肾病的分子机制尚不明确。本研究评估了在STZ诱导的糖尿病肾病大鼠中黄葵胶囊的治疗作用，及其中可能的机制。我们的结果表明黄葵胶囊明显改善糖尿病肾病大鼠的神纤维化，显著降低了大鼠血清肌酐、尿素氮和尿蛋白。同时，我们发现黄葵胶囊可下调TGF-β1、α-SMA和ILK的mRNA表达水平。综上，黄葵胶囊在糖尿病肾病中有明确的治疗作用，并可能通过降低TGF-β1、α-SMA、ILK表达水平实现。