薄荷油纳米乳液消化规律与稳定性研究

王中江 张潇元 车佳玲 李 杨 OLGA O B 江连洲

(1.东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030； 2.克麦罗沃国立大学食品学科与技术学院， 克麦罗沃 650056)

0 引言

薄荷油具有多种功效[1]，有着巨大的应用发展空间与潜力。然而薄荷油易挥发，对空气、温度、光的稳定性差以及其主要功能性成分在未到达目标位置前，被机体迅速吸收，最终会导致营养素的生物利用度降低等缺点[2]，极大限制了其在食品、保健品等领域的应用。

纳米乳液乳化包埋体系具有独特的纳米级粒径和较大的比表面积。除了能很好地提高精油类生物活性物质的生物利用度以外，纳米乳化包埋体系具有在储藏、运输过程中无絮凝、无聚集的优点[3-4]。MAJEED等[5]以改性淀粉辛烯基琥珀酸酯化淀粉作为乳化剂制备了不同粒径的丁香酚纳米乳液，通过模拟体外胃肠道消化，表明小粒径的纳米乳液生物利用度更高。RAO等[6]通过模拟体外胃肠道消化，研究了玉米油对β-胡萝卜素纳米乳液稳定性、脂肪酸释放率及β-胡萝卜素生物利用度的影响。研究表明油相中玉米油的存在不仅提高了机体内的消化速度，同时提高了脂肪酸释放率以及β-胡萝卜素的生物利用度。然而，目前国内外尚无关于薄荷油纳米乳液的研究。

本文研究薄荷与纳米乳液经体外胃肠液消化后其粒径、ζ-电位的变化以及游离脂肪酸释放率和薄荷醇的生物利用度，以及包埋后薄荷油的稳定性，以期为纳米乳化包埋技术制备的薄荷油纳米乳液应用于营养素的体内运载提供数据支持和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(Soybean protein isolate,SPI)，蛋白质量分数89.21%，山东省高唐蓝山集团；磷脂酰胆碱(Phosphatidyl choline,PC)，北京索莱宝科技有限公司；薄荷油、尼罗蓝、尼罗红、胃蛋白酶、胰蛋白酶、猪胆酸盐，Sigma公司；氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

T18 Basic型高速分散机(德国IKA公司)；实验型高压均质机(英国Stansted Fluid Power公司)；超净工作台(美国PE公司)；激光扫描3D共聚焦显微镜(英国Malvern仪器有限公司)；Zetasizer Nano ZSP型纳米粒径电位仪(英国Malvern仪器有限公司)；Agilent7890-5795C型气相色谱-质谱联用仪(日本HITACHI公司)；多重光散射稳定性分析仪(法国Formulaction公司)。

1.3 方法

1.3.1薄荷油纳米乳液的制备

参照LEE等[7]方法将SPI和PC溶于0.1 mol/L、pH值7.0的磷酸盐缓冲液中，置于25℃条件下连续搅拌120 min，形成水相，在高速分散机的搅拌下把薄荷油作为油相加到水相中，20 000 r/min剪切5 min，形成粗乳液。将粗乳液通过高压均质机进一步均质乳化即得薄荷油纳米乳液。高压均质处理的方法及条件设定参照SORGENTINI等[8]方法进行一定修改。高压均质机均质压力为80 MPa，均质次数为4次，采用冰水浴保持低温。

1.3.2纳米乳液激光扫描3D共聚焦显微镜成像

薄荷油纳米乳液体系激光共聚焦显微镜的检测参照PUPPO等[9]的方法。SPI经尼罗蓝染液染色后呈现绿色荧光，薄荷油经脂溶性荧光探针尼罗红染色后呈现红色荧光。分别将尼罗红(0.01 g/mL)和尼罗蓝(0.01 g/mL)溶解在丙醇中，漩涡混合30 s后对薄荷油纳米乳液染色40 min。染色结束后取10 μL乳液于载玻片上，采用激光扫描3D共聚焦显微镜观察薄荷油纳米乳液的微观结构。

1.3.3纳米乳液体外模拟消化

根据人体消化道的构造以及蛋白和油脂在机体内的消化特点，参照WOOSTER等[10]的实验方法并在其基础上进行改进后，构建一个胃肠道模型，以模拟胃液、肠液消化。在整个实验过程中，消化乳液样品置于37℃恒温振荡摇床上，并通过磁力搅拌器持续搅拌。

(1)模拟胃阶段

首先，取15 mL薄荷油纳米乳液与135 mL生理盐水混合，持续搅拌10 min，通过0.1 mol/L的盐酸调节消化液的pH值至2.0，加入10 mL质量浓度为40 mg/mL的胃蛋白酶。然后将溶液置于37℃的振荡摇床中模拟胃液消化1 h。

(2)模拟肠阶段

在经过模拟胃液消化1 h后，使用0.1 mol/L NaOH将消化液的pH值调至7.5，并加入45 mL模拟肠液(2 mg/mL的胰酶与12 mg/mL的猪胆酸盐)，模拟肠液的消化。溶液的pH值用pH-stat法自动滴定监测，在37℃条件下反应2 h，并通过滴加0.2 mol/L NaOH溶液保持pH值为7.5，并记录NaOH消耗量。参照NETZEL等[11]的研究方法，采用与薄荷油纳米乳液中相同质量浓度的薄荷油作为空白对照。

(3)游离脂肪酸释放率测定

模拟肠液的消化过程中，薄荷油在胰脂肪酶和猪胆酸盐的作用下被水解为游离脂肪酸，一分子的甘油三酯在完全消化时产生一分子的甘油单酯和两分子的游离脂肪酸，因此根据随时间推移不断消耗的NaOH体积计算出游离脂肪酸的释放率，公式为

(1)

式中Y1——游离脂肪酸释放率，%

mlipid——乳液中脂肪的总质量，g

VNaOH——所消耗的NaOH溶液的体积，L

mNaOH——滴定时选用NaOH溶液的浓度，mol/L

Mlipid——脂肪分子的平均分子量，g/mol

1.3.4薄荷醇生物可利用度测定

将消化后的乳液置于离心机中，在4℃、10 000g条件下离心45 min，上清液即为载有薄荷醇的透明胶束层，利用高效液相色谱-质谱联用仪的方法即可计算出薄荷醇的浓度，薄荷醇的生物可利用度计算公式为

(2)

式中Y2——薄荷醇生物利用度，%

C1——胶束中薄荷醇浓度

C2——溶液中薄荷醇浓度

(1)高效气相色谱-质谱联用仪测定条件

气相色谱：采用OV1701型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样量10 μL，升温程序设定为：40℃持续3 min，然后以4℃/min的速度上升至100℃，接着以7℃/min的速度上升至240℃，持续7 min，分流比设定10∶1。载气为氦气，流速设定为0.8 mL/min，进样口温度设定为250℃。

质谱：离子源温度设定为200℃，检测器电压为350 V，电子能量设定为70 eV，灯丝发射电流200 μA，接口温度250℃，扫描范围(质荷比)50～500。

(2)化合物鉴定

利用Xcalibur软件对实验数据进行分析。通过计算机自动查找化合物，然后与谱库NIST和Wiley的化合物进行匹配度检测，再手动检索核对，选择匹配度大于800的结果，采用归一化法得到样品中薄荷醇的浓度。

1.3.5消化纳米乳液平均粒径及ζ-电位测定

采用Zetasizer Nano-90型粒径分析仪测定原始纳米乳液及经胃液和肠液消化后液体的平均粒径及ζ-电位。测定前先将乳液用0.1 mol/L、pH值7.0的磷酸盐缓冲溶液以1∶1 000比例稀释，以防止多个角度的散射效应。

1.3.6消化乳液形态观察

吸取一滴乳液置于载玻片上，盖上盖玻片，用光学显微镜观察外观形态，放大400倍并进行拍照。

1.3.7薄荷油纳米乳液的稳定性分析

利用浓缩体系稳定性分析仪对薄荷油纳米乳液的稳定性进行检测，通过两个同步探测器收集背散射光和透射光，获得差值反射光量随时间的动态变化情况，进而得到对纳米乳液的稳定性情况。取20 mL薄荷油纳米乳液置于仪器专用玻璃杯中，温度保持在55℃，每30 min扫描一次，共扫描5次，软件通过光信号，计算纳米乳液的稳定性分析指数(TSI值)。

1.3.8数据统计分析

每次试验做3次平行，结果用平均值±标准差表示，利用SPSS Statistics 22软件对数据进行ANOVA差异显著性分析，P<0.05为显著性差异。采用Origin 9.1软件进行数据分析、图表处理及图谱分析处理。

2 结果与分析

2.1 纳米乳液形态的激光扫描3D共聚焦显微镜成像

激光扫描3D共聚焦显微镜更为直观地显示了薄荷油纳米乳液纳米级液滴均匀分布情况。其原理是在荧光显微镜的基础上装上激光扫描装置，使用激光集中扫描照射样品的表面，然后通过激发荧光探针将聚焦平面的信息投射到检测器前面的共聚焦孔中[12]。并利用3D成像软件进行图像处理，进而得到纳米乳液微观结构的荧光图像。本研究利用荧光标记蛋白技术，通过尼罗红与尼罗蓝快速标记纳米乳液的脂肪和蛋白质，检测薄荷油纳米乳液体系对薄荷油的包埋效果。如图1所示，观察到大部分离散的球形脂肪液滴直径在10～200 nm范围内，由于尼罗蓝覆染SPI后激发的荧光呈绿色，结果表明高压均质处理的SPI具有较好的乳化活性，可以形成紧密的界面膜，呈现球状形态，提高了乳化体系的稳定性。

图1 薄荷油纳米乳液的激光扫描3D共聚焦显微镜图像Fig.1 Microscope images of peppermint oil nanoemulsion by confocal laser scanning 3D microscopy

2.2 纳米乳液在体外消化过程中的粒径和微观结构变化

薄荷油纳米乳液通过体外模拟消化模型后，其乳化体系的组成和结构均出现了显著变化，同时对乳液的理化稳定性影响较大。因此，在实验过程中检测了薄荷油原始乳液的平均粒径以及经过模拟胃液消化60 min、模拟肠液消化120 min后的平均粒径[13]，并且利用光学显微镜可更为直观地显示乳液消化各阶段的微观结构，结果如图2所示。在体外模拟消化的整个过程中，乳液的平均粒径呈现先增加后下降的变化趋势。基于SPI的薄荷油纳米乳液具有相对较小的粒径，同时油-水界面吸附着大量的蛋白，形成一层保护膜，保证乳液能维持较稳定的状态。当乳液经过胃液时，平均粒径显著增加，主要原因在于胃液中的胃蛋白酶能水解吸附在薄荷油上的SPI，另一方面当胃液的pH值在SPI等电点附近且胃液中含有金属离子时，液滴间的静电排斥作用下降，导致乳液裂解或出现液滴聚合。这与MALAKI等[14]的研究结果一致。当乳液在肠液消化120 min后，乳液的平均粒径降低到300 nm，主要原因在于薄荷油被肠液中的胰脂肪酶和猪胆酸盐水解成小液滴，同时静电排斥作用的增强以及持续的机械振荡进一步阻止了液滴出现聚合现象。KOSSENA等[15]研究指出β-胡萝卜素纳米乳液体外模拟肠液消化过程中出现平均粒径增大的情况。而本文所研究的薄荷油纳米乳液在肠液消化后没有出现液滴聚集现象，结果表明SPI-PC的疏水作用对薄荷油纳米乳液的油-水界面膜有一定的抗液滴聚合作用。

图2 纳米乳液消化前后的光学显微镜图像Fig.2 Optical microscope images of peppermint oil nanoemulsion before and after digestion

2.3 纳米乳液在体外消化过程中的ζ-电位变化

薄荷油纳米乳液经胃液、肠液消化前后的样品中，ζ-电位也是决定乳液体外模拟消化过程中界面组成变化的因素，不同消化阶段纳米乳液ζ-电位结果表明消化乳液的ζ-电位绝对值整体呈现先下降后上升的趋势。根据2.1节薄荷油纳米乳液的激光扫描3D共聚焦显微镜可以看出，在薄荷油纳米乳液的油-水界面吸附了大量的SPI，表明乳液在初始阶段吸附大量负电荷。由于体外模拟的胃液pH值较低以及高离子强度的静电屏蔽作用[16]，乳液在进行胃液消化过程中表面负电荷密度降低，进而导致ζ-电位绝对值下降。该结果与TRONCOSO等[17]的研究结论相一致。然而，在体外模拟胃液消化过程中，消化液的ζ-电位仍然呈负值，这是因为SPI-PC的疏水作用与PC表面分子的表面空间位阻作用导致带负电荷的PC掩盖了SPI的正电荷。当薄荷油乳液经过肠液时ζ-电位绝对值显著增大，分析原因如下：薄荷油在脂肪酶水解后释放阴离子的游离脂肪酸和单甘脂导致消化液的净电荷增加，同时在pH值为7.5的环境中，带负电荷的脂质、蛋白、胆盐等物质极易取代蛋白吸附到油-水界面处，导致乳液经过小肠液后带有大量的负电荷，然而胆盐、脂质的负电荷量低于液滴界面蛋白，因此蛋白质被置换出界面后，乳化体系总的界面负电荷量下降而没有回到初始的ζ-电位。

2.4 纳米乳液的油脂消化分析

目前，国内外很多食品、药品领域学者利用pH-stat法检测体外模拟肠液消化过程中油脂的游离脂肪酸释放率变化[18]。通过测定模拟肠消化过程中游离脂肪酸的释放率可以用来判断薄荷油纳米乳液油相的水解程度与速率。消化乳液进入小肠后，甘油三酯被胰脂酶和猪胆酸盐脂解生成甘油单酯、甘油二酯和游离脂肪酸[19]，为了保持肠液消化体系在pH值7.5条件下不变，需要不断加入NaOH中和水解过程中生成的游离脂肪酸，同时通过计算此过程中消耗NaOH的量计算游离脂肪酸释放率。图3为薄荷油纳米乳液体外模拟消化过程中游离脂肪酸的释放曲线。从该图可以看出，在游离脂肪酸的释放率呈现先迅速增加后缓慢上升的变化趋势，而对于空白对照薄荷油的游离脂肪酸释放率始终趋于平缓，经过120 min模拟肠液消化后，薄荷油纳米乳液的游离脂肪酸释放率达到104.3%，与SALVIA-TRUJILLO等[13]的研究结果一致，表明薄荷油纳米乳液的油相在消化过程中能被完全水解。比较发现空白对照薄荷油的游离脂肪酸释放率仅为30.4%，表明纳米乳化体系可以有效地提高油脂的游离脂肪酸释放率。分析原因在于薄荷油脂解属于界面反应，由于纳米乳化包埋体系中的油相在一定程度上具有较大的表面积，油-水界面上吸附的蛋白减少，空间位阻作用减弱，更有利于胰脂肪酶与油脂的接触反应，从而提高脂解效率。同时胰酶中的磷脂酶A2可促进消化PC结构中的sn-2键，生成2-酰基溶血磷脂，该消化产物可破坏磷脂乳化层结构，并且猪胆盐中的胆固醇酶可激活胆固醇酶催化消化PC，进一步提高了游离脂肪酸释放率，由于猪胆汁盐可激活胆固醇酶催化消化PC，形成游离脂肪酸，因此纳米乳化体系的游离脂肪酸释放率高于100%，也是由于PC的消化所致。在对照组中，游离的油相不溶于水，减缓了脂解的过程，降低了游离脂肪酸释放率。

图3 薄荷油纳米乳液在肠消化中的游离脂肪酸释放率变化曲线Fig.3 Change of FFA release rate of peppermint oil nanoemulsion in intestine digestion

2.5 纳米乳液中薄荷醇生物可利用度分析

薄荷油纳米乳液中的生物活性物质会在体外模拟消化过程中变化。纳米乳化后的薄荷油会不断在胰脂肪酶和猪胆酸盐作用下水解，并被载入到由胆盐、PC、脂肪酸组成的混合胶束中，进而被小肠上皮细胞吸收[20]。因此可以通过测定胶束中薄荷醇的浓度得到薄荷醇的生物可利用度。结果表明，与对照组薄荷油中的薄荷醇生物可利用度3.4%比较，采用纳米乳化体系包埋的薄荷醇生物可利用度为84%，表明纳米乳化体系提高了薄荷醇的生物可利用度，游离脂肪酸释放率的增加有利于被包埋生物活性物质的生物可利用度的提高，YU等[21]的研究结果也表明油相的水解程度与生物活性物质的生物可利用度之间呈正相关。与其他类似生物活性物质的研究比较，发现此结果要高于WANG等[22]使用月桂酸十甘油酯作为表面活性剂时的结果。GOLDING等[23]发现，生物活性物质在体外模拟消化的胶束化过程中极易因界面上表面活性剂的竞相吸附受到影响，在此过程中，胆盐和PC替换原有表面活性剂分子而吸附到油-水界面处，形成胶束。因此，表面活性剂组分与结构特性也影响生物活性物质的胶束化过程。本文以PC作为表面活性剂，在胶束形成过程中直接用于构建胶束，SPI因生物酶水解形成氨基酸与小分子多肽降低了油-水界面处的吸附膜厚度，更容易被PC和胆盐替换，进而得到更高的生物可利用度。

2.6 纳米乳液的稳定性分析

传统检测乳液稳定性的方法通常采用离心加速实验,通过观察上浮层高度来判断乳液的稳定性[24]。多重光散射稳定性分析技术采用激光光源将薄荷油纳米乳液从底部扫描至顶部，在不利用外界作用力的情况下通过光学传感器收集乳液样品的透射光和背散射光随乳液高度和时间的变化，在较短的时间内监测出乳液的稳定性并得到TSI(稳定性指数)值，具有实验进展快速、实验结果准确、客观等优势[25]。实验结果如图4所示，薄荷油稳定性指数结果为2.8，结果表明在扫描高度为0.085～4.97 mm的样品瓶底部出现背散射光强度上升现象，薄荷油纳米乳液的底部背散光强度范围为33.34%～35.62%，表明薄荷油纳米乳液出现轻微乳析现象，扫描高度在15～30 mm范围内，乳液的中部背散射光强度范围为46.56%～47.48%，表明薄荷油纳米乳液很少有液滴聚合现象，扫描高度在40～43.6 mm范围内，乳液的顶部背散射光强度在38.73%～45.89%，结果表明薄荷油纳米乳液出现脂肪液滴发生轻微的上浮[26]。上述结果表明，在8 h的测量过程中，薄荷油纳米乳液仅出现了由分散相与连续相的密度差引起的颗粒上浮现象，并未发生粒径上的变化，这是因为SPI为非离子表面活性剂，在乳液中不存在因电荷作用引起的液滴之间的吸附或排斥。因此通过高压均质制备得到的薄荷油纳米乳液稳定性良好。

图4 薄荷油纳米乳液的稳定性分析图Fig.4 Analysis diagrams of stability of peppermint oil nanoemulsion

3 结束语

本研究考察薄荷油纳米乳液在体外模拟消化过程中乳液包埋对平均粒径、ζ-电位、游离脂肪酸释放率以及薄荷醇生物可利用度的影响。激光扫描3D共聚焦显微镜结果表明纳米乳液中薄荷油完全被SPI包埋，呈核壳状结构。高压均质处理制备的薄荷油纳米乳液的游离脂肪酸释放率及薄荷醇生物可利用度远大于薄荷油的对照组。薄荷油纳米乳液在模拟胃消化阶段，乳液的平均粒径、ζ-电位均变大，乳液的微观结构表明消化体系出现液滴聚合现象；在模拟肠液消化后，薄荷油纳米乳液的界面蛋白被水解，油滴被消化，乳液的平均粒径减小、ζ-电位绝对值增加。根据多重光散射稳定性分析仪扫描图谱可知，薄荷油纳米乳液在55℃条件下检测8 h并未出现乳液上浮和絮凝等现象，结果表明高压均质制备的纳米乳液具有良好的稳定性。