甘遂半夏汤的UPLC—DAD指纹图谱研究

2018-10-19洪博刘军张杰徐天娇王玉春李文静

中国药房 2018年17期

洪博刘军张杰徐天娇王玉春李文静

中图分类号 R917 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）17-2373-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.16

摘要目的：建立甘遂半夏汤的指纹图谱，为完善其质量控制提供参考。方法：采用超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UPLC-DAD）法建立13批甘遂半夏汤的指纹图谱，色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3，流动相为0.1%甲酸-乙腈（梯度洗脱），流速为0.5 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为35 ℃，进样量为4 μL。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）对指纹图谱进行评价，并采用SPSS 13.0软件对各样品进行聚类分析。结果：方法学考察中，各色谱峰的保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%（n=6）。13批甘遂半夏汤指纹图谱的相似度均大于0.95，确定了21个共有色谱峰，并指认了其中芍药苷、甘草苷及甘草酸3个共有色谱峰。聚类分析结果显示，甘遂半夏汤样品分为2类。结论：建立的UPLC-DAD指纹图谱体现了甘遂半夏汤组分的整体特征，为甘遂半夏汤制剂质量标准的建立提供了可靠依据。

关键词甘遂半夏汤；超高效液相色谱-二极管阵列检测器法；指纹图谱；质量控制

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the fingerprints of Gansui banxia decoction， and to provide reference for improving quality control. METHODS： UPLC-DAD was used to establish the fingerprints of 13 batches of Gansui banxia decoction. The determination was performed on Waters Acquity UPLC HSS T3 column with mobile phase consisted of 0.1% formic acid- acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.5 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm， and column temperature was 35 ℃. The sample size was 4 μL. Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2004A edition） was used to evaluate the fingerprints. SPSS 13.0 software was used for cluster analysis of those samples. RESULTS： In the methodology validation， RSDs of retention time and relative peak area were all lower than 2% for each peak （n=6）. The similarity of fingerprints for 13 batches of Gansui banxia decoction was higher than 0.95； 21 common chromatographic peaks were marked， and 3 common chromatographic peaks of paeoniflorin， liquiritin， glycyrrhizic acid were identified. The results of cluster analysis indicated that Gansui banxia decoction samples were classified into 2 classes. CONCLUSIONS： The established UPLC-DAD fingerprint shows the overall characteristics of components in Gansui banxia decoction. It provides reliable evidence for the establishment of quality standard for Gansui banxia decoction.

KEYWORDS Gansui banxia decoction； UPLC-DAD； Fingerprint； Quality control

甘遂半夏湯收载于《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治》，有攻逐水饮、洁净肠腑之功效[1]。甘遂半夏汤由甘遂、半夏、芍药、甘草组成，方中甘遂为君，降逆，攻逐饮邪，善行肠间经隧之饮邪；半夏为臣，醒脾燥湿，化饮降逆，宣畅气机；芍药补血益阴缓急，甘草益气和中，同为佐[2-3]。虽然本方中甘遂药性峻猛，有一定毒性，加之与甘草配伍的“十八反”禁忌，但其仍有广泛的临床应用，主要用于治疗（结核性）胸膜炎、肝硬化腹水、肾积水、肺源性心脏病腹水、慢性腹泻等[4-7]。现代药理实验也表明，该方对实验性大鼠心包积液、尿毒症、肾积水、肝硬化腹水、肝癌、高血糖及甲状腺功能紊乱等都有一定的改善作用[8-12]。

近年来，关于甘遂半夏汤的研究多集中在药理作用及临床应用方面，质量标准研究鲜有报道。对本方中的甘遂、半夏、芍药、甘草单味药材的指纹图谱已有大量的文献报道[13-16]，但目前未见甘遂半夏汤指纹图谱研究的相关报道。为了进一步完善我国有效方剂质量标准，本研究以经典名方甘遂半夏汤为研究对象，建立超高效液相色谱-二极管阵列检测器（UPLC-DAD）指纹图谱，为其质量标准的建立提供一定参考。

1 材料

1.1 仪器

Acquity UPLC-H-Class高效液相色谱（HPLC）仪，包括四元泵洗脱系统、自动进样系统、柱温箱及DAD（美国Waters公司）；BSA224S-CW高分辨电子天平（德国Sartorius公司）；5417R台式高速离心机（德国Eppendorf科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

13批药材分别购自齐齐哈尔新药特药大药房（标记为S1，批号：20160221；S13，批号：20160311）、齐泰药店（标记为S2，批号：20151218；标记为S3，批号：20151129；标记为S4，批号：20160923；标记为S5，批号：20161211；标记为S6，批号：20160823）、齐市建华区鸿福大药房（标记为S7，批号：20160923）、齐齐哈尔市鹤城中药批发站卜奎药店（标记为S8，批号：20170223；标记为S9，批号：20171129；标记为S10，批号：20161117；標记为S11，批号：20171202）和齐齐哈尔康盈国药堂中药店（标记为S12，批号：20161214），所购药材经齐齐哈尔医学院药学院中药教研室主任郭丽娜教授鉴定均为真品，符合2015年版《中国药典》（一部）药材标准的有关规定，并留样于齐齐哈尔医学院药学院中药材标本室；芍药苷对照品（批号：160524，纯度：99%）、甘草苷对照品（批号：161201，纯度：98.5%）及甘草酸对照品（批号：160602，纯度：98.5%）均购自上海博顿生物化工有限公司；甲醇、乙腈（美国Fisher公司，色谱级）；甲酸（美国Tedta公司，色谱级）；无水乙醇（济南世纪通达化工有限公司，分析纯）；水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm ×2.1 mm，1.8 μm），预柱为Waters Acquity UPLC HSS T3（5 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：A为0.1%甲酸，流动相B为乙腈，梯度洗脱（0～2 min，90%～80%A；2～5 min，80%～60%A； 5～10 min，60%～45%A； 10～15 min，45%～0%A； 15～16 min，0%A）；流速：0.5 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进样量：4 μL。

2.2 供试品溶液的制备

按照《金匮要略》甘遂半夏汤处方比例，精密称取甘遂0.3 g、半夏0.9 g、芍药1.5 g、甘草0.6 g，置于同一圆底烧瓶中，加入70%乙醇60 mL回流提取2次，每次1 h，抽滤，合并2次滤液，浓缩至60 mL，称质量；将滤液放至室温后再次称质量，用70%乙醇补足损失的质量。然后将滤液以17 217×g离心5 min，收集上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 混合对照品溶液的制备

精密称取芍药苷、甘草苷和甘草酸对照品适量，置于同一5 mL棕色瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，制备成每mL含芍药苷400 μg、甘草苷510 μg 和甘草酸620 μg的混合对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性取“2.2”项下供试品（S1）溶液、 “2.3”项下混合对照品溶液，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。结果，供试品溶液色谱图中的芍药苷、甘草苷和甘草酸的测定与其他成分不存在明显的干扰，表明本方法对甘遂半夏汤中指认成分的检出具有较好的专属性。

2.4.2 精密度取同一供试品（S1）溶液4 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱。以甘草酸的保留时间和峰面积为参照，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%（n=6），表明仪器的精密度良好，符合指纹图谱的要求。

2.4.3 稳定性取同一供试品（S1）溶液，分别于制备后的0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。以甘草酸的保留时间和峰面积为参照，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%（n=8），表明样品溶液在室温条件下24 h内稳定。

2.4.4 重复性取同批次样品（S1）6份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱。以甘草酸的保留时间和峰面积为参照，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

取13批药材，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，并以混合对照品溶液进样进行色谱峰的定位。然后将13批色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）版，以样品S1的图谱为参照图谱R，设定时间窗宽度为0.5 min，自动匹配生成13批样品的指纹图谱；并以样品S1的图谱为参照图谱，采用自动匹配模式进行相似度评价。供试品（S1）溶液与混合对照品溶液的典型色谱见图1，13批样品的指纹图谱见图2，相似度评价结果见表1。

结果显示，13批样品色谱图的相似度均大于0.95。共得到21个共有色谱峰，并指认了其中的3个共有色谱峰：2号共有色谱峰为芍药苷、4号共有色谱峰为甘草苷和11号共有色谱峰为甘草酸。

2.6 聚类分析

以共有峰峰面积为变量，运用SPSS 13.0软件对13批样品进行聚类分析，得出树状图。聚类谱系中，当判别条件距离di=10时，将13批样品分为3类：S2、S3、S4、S5、S6、S8、S9、S10、S11、S12批次样品聚为一类，S1、S13批次样品聚为一类，S7批次样品聚为一类；当判别条件距离di=15时，将13批样品分为2类：S1、S7、S13批次样品聚为一类，其余10批次样品聚为一类。这说明药材的产地可能不同，由于气候、生长环境、采收时间等因素，会影响药材中化学成分的含量，造成药材质量的差别较大，影响由各个药材组成的中药复方甘遂半夏汤中化学成分的含量差别，最终影响该方药效的发挥。13批甘遂半夏汤的聚类树状图见图3。

3 讨论

特征中药指纹图谱是中药质量控制的有效途径，是保证中药安全、有效的重要环节，为中药质量评价提供了新思路和新方法。本研究共标定了21个共有色谱峰，并指认了其中3个共有色谱峰。13批样品的指纹图谱相似度均大于0.95，说明不同来源或批次甘遂半夏汤的化学组成的一致性较好，这为其质量标准研究奠定了一定的物质基础，同时也为我国经典名方的现代化研究和开发提供了一种新思路。

3.1 色谱方法的选择

在前期研究中，笔者分别采用了HPLC法和UPLC法进行甘遂半夏汤指纹图谱的建立分析，发现HPLC法分析时间较UPLC法更长，且甘遂半夏汤中的各成分的色谱峰有拖尾的现象，而采用UPLC法分析后，色谱峰峰形较好，分析效率更高，可显著缩短分析时间以及减少流动相的消耗，故在本研究中采用UPLC法進行指纹图谱的构建。

3.2 流动相的选择

在前期研究中，笔者分别对甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲酸-水和0.1%磷酸-水等流动相组成进行了考察。结果表明，以0.1%甲酸-乙腈为流动相系统时分离效果最佳，各峰间分离度和峰形均更好，保留时间也合适。因此，本研究选择0.1%甲酸-乙腈为流动相体系进行梯度洗脱。

3.3 检测波长的选择

笔者采用DAD在200～400 nm波长范围内进行全波长扫描，并参考甘遂、半夏、芍药及甘草的检测波长，发现供试品在254 nm波长处出峰数最多，各峰间分离度良好，特征峰明显且峰形较好，能较好地反映甘遂半夏汤的整体化学形态及色谱保留行为，故在本研究中选定254 nm为检测波长。

3.4 样品提取溶剂的选择

本研究选用70%乙醇为溶剂进行样品提取，是因为乙醇的溶解性能较好，对中草药细胞的穿透能力较强，用乙醇提取比用水提取的用量更少，且提取时间较短，溶解出的水溶性杂质也少。乙醇虽为有机溶剂但毒性小，可反复回收使用，而且乙醇提取液不易发霉变质，所以用乙醇提取也是中药材成分分析样品处理的常用方法之一。

本研究的目的主要是建立甘遂半夏汤的指纹图谱，为甘遂半夏汤的质量标准奠定基础，所以用乙醇提取更利于分析甘遂半夏汤的主要成分及对其质量进行分类分析。但不足之处是未对甘遂半夏汤的水煎剂进行分析，后者的分析结果更适合指导临床用药，故本课题组接下来的研究重点将是在本研究基础上针对甘遂半夏汤水煎液进行成分分析。

参考文献

[ 1 ] 张仲景.金匮要略[M].北京：人民卫生出版社，2012：49.

[ 2 ] 王付.学用甘遂半夏汤方证的思考与探索[J].中医药通报，2015，14（1）：14-16.

[ 3 ] 程力敏，李景凡.甘遂半夏汤方证刍议[J].中医药学报，1987，13（5）：33-34.

[ 4 ] 赵桐，钟赣生，张建美，等.含甘遂-甘草反药组合的甘遂半夏汤临床用药分析[J].中国临床医生杂志，2014，42（12）：89-91.

[ 5 ] 刘宾，孙宁，王付.甘遂半夏汤的临床应用[J].河南中医，2014，34（12）：2297-2298.

[ 6 ] 陈锐.甘遂半夏汤临床新用[J].中国社区医师，2011，13（24）：28-29.

[ 7 ] 刘超.甘遂半夏汤治疗痰饮久泻1例[J].中国社区医师，2010，12（27）：150-152.

[ 8 ] 王茜，钟赣生，王宏蕾，等.甘遂半夏汤中甘遂与甘草不同比例配伍对癌性腹水模型大鼠生物效应影响的研究[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（4）：177-181.

[ 9 ] 王付，程秀娟，张大伟，等.甘遂半夏汤对正常大鼠心肾功能及形态学的影响[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（8）：155-159.

[10] 王付，程秀娟，王帮民，等.甘遂半夏汤对大鼠肝功能及形态学的影响[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（8）：160-164.

[11] 王付，程秀娟，王帮民，等.甘遂半夏汤对大鼠血常规血糖及甲状腺形态的影响[J].中国实验方剂学杂志，2015，21（8）：165-168.