LC—MS/MS法测定犬血浆中阿莫西林的浓度及其药动学研究

张元元 王晨 张斗胜 周从亚 杨丽 赵荣生 翟所迪 张现化

中圖分类号 R969.1；R978.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2018）23-3193-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.23.06

摘 要 目的：建立测定犬血浆中阿莫西林浓度的方法，研究其药动学特征。方法：取12只比格犬，灌胃阿莫西林胶囊250 mg，分别于给药前和给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、10 h取血1.0～1.5 mL，以阿莫西林-d4为内标，血浆样品经酸性乙腈沉淀后，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定其中阿莫西林的血药浓度。色谱条件为色谱柱Waters Atlantis dC18，流动相乙腈（含0.1%甲酸）-10 mmol/L甲酸铵水溶液（pH 4.5），采用梯度洗脱的方式，流速0.3 mL/min，柱温30 ℃，进样量1 ?L；质谱条件为电喷雾离子源，正离子模式，扫描方式为多反应监测，离子源喷雾电压5.5 kV，离子源温度450 ℃，雾化气压力30 psi，加热气压力40 psi，阿莫西林离子对m/z 366.2→113.9，内标离子对m/z 370.2→353.0，二者碎裂电压分别为26、16 V，驻留时间均为200 ms。结果：阿莫西林检测质量浓度在0.1～16 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.998 2），日内、日间精密度的RSD分别小于14.3%、11.8%（n=5），准确度为93.0%～112.0%（n=3）；提取回收率为58.9%～63.3%（RSD=3.3%，n=3），基质效应为2.8%（n=6），稳定性试验的RSD均小于15%（n=3）。阿莫西林在犬体内的药动学符合一室模型，t1/2为1.56 h、10 h内的药-时曲线下面积（AUC0-10 h）为24 300 ng·h/mL、cmax为7 523 ng/mL。结论：该方法灵敏、准确、简便、快速，可用于犬血浆中阿莫西林的血药浓度测定及药动学的研究。

关键词 阿莫西林；液相色谱-串联质谱法；比格犬；血药浓度

ABSTRACT OBJECTIVE： To develop the method for the determination of amoxicillin concentration in dog plasma， and to study its pharmacokinetic characteristics. METHODS： Totally 12 Beagle dogs were collected and given Amoxicillin capsules 250 mg intragastrically. The 1.0-1.5 mL plasma samples were collected before medication， and 0.5， 1， 1.5， 2， 2.5， 3， 3.5， 4， 4.5， 5， 5.5， 6， 8， 10 h after medication. Using amoxicillin-d4 as internal standard （IS）， after precipitated with acidic acetonitrile， the plasma concentration of amoxicillin was determined by LC-MS/MS. The separation was performed on an Atlantis dC18 column with mobile phase consisted of acetonitrile （containing 0.1% formic acid）-10 mmol/L ammonium formate water solution （pH 4.5， gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 1 ?L. Mass spectrum condition included ESI， positive ion mode， multiple reaction monitoring， ion source spray voltage 5.5 kV， ion source temperature 450 ℃， atomizing gas pressure 30 psi， heater pressure 40 psi， ion pair m/z 366.2→113.9 and m/z 370.2→353.0 for amoxicillin and IS， fragmentation voltage 26 and 16 V， residence time 200 ms. RESULTS： The linear range of amoxicillin was 0.1-16 μg/mL （r=0.998 2）. RSDs of intra-day and inter-day were lower than 14.3% and 11.8% （n=5）. The accuracy was 93.0%-112.0% （n=3）. The extraction recoveries were 58.9%-63.3% （RSD=3.3%， n=3）， and matrix effect was 2.8%（n=6）. RSDs of stability test was lower than 15% （n=3）. By single compartment model， the pharmacokinetic parameters of amoxicillin included that t1/2 was 1.56 h， AUC1-10 h was 24 300 ng·h/mL and cmax was 7 523 ng/mL. CONCLUSIONS： The method is sensitive， accurate， simple and rapid. It is applied for the determination of amoxicillin concentration in the plasma of dog and the pharmacokinetic study of amoxicillin.

KEYWORDS Amoxicillin； LC-MS/MS； Beagle dog； Plasma concentration

阿莫西林（Amoxicillin）是一种半合成广谱β-内酰胺类抗菌药物。在化学结构上，由于羟基和氨基的引入，阿莫西林具有很好的耐酸性，比一般青霉素更适合口服且抗菌谱更广，应用广泛，但在临床上可引起有多种不良反应[1-4]。青霉素类制剂普遍存在副反应，其中以阿莫西林的报道最多，因此必须严格控制其用量。由于阿莫西林分子中含有的β-内酰胺结构，在水、强酸、强碱及青霉素酶等的作用下容易水解破裂，进而失去活性，甚至聚合产生致敏性杂质，导致人体产生严重的过敏反应。因此，在开展仿制药一致性评价之前，需对仿制药的药动学、药效学及毒理学性质进行全面的评估。本研究参考已报道的阿莫西林血药浓度的液质联用检测方法[5-10]，并加以改进，建立了一种更加稳定、样本需要量更少的液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），并考察将其用以研究阿莫西林在比格犬体内的药动学特征，以期为阿莫西林的质量监控提供一种新的检测方法。

1 材料

1.1 仪器

液质联用仪，包括Shimadzu 20AD液相色谱仪（日本岛津公司）；Sciex 5500 QTrap质谱仪（美国Sciex公司）；MS3 digital涡旋混合器（德国IKA公司）；BT25S电子天平（德国Sartorius公司）；3-18K离心机（美国Sigma公司）；Cascada-I纯水机（美国Pall公司）。

1.2 药品与试剂

阿莫西林对照品（中国食品药品检定研究院，批号：30409-201011，纯度：85.8%）；阿莫西林-d4标准品（内标，美国TRC公司，批号：7-YHH-23-1，纯度：96.0%）；阿莫西林胶囊（中国某药企提供，批号：01，规格：每粒250 mg）；乙腈、甲酸、醋酸铵以及甲酸铵均为色谱纯。

1.3 动物

比格犬，普通级，♀♂各6只，8～12月龄，体质量为7.78～9.48 kg，来源于北京日新科技有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（京）2016-0004。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 溶剂 0.01 mol/L醋酸铵缓冲液（pH 4.5）-甲醇 （1 ∶ 1，V/V）溶液。

2.1.2 对照品溶液 精密称取阿莫西林对照品适量，用溶剂配制成质量浓度为1.0 mg/mL的对照品贮备液，再用溶剂稀释制成所需质量浓度的对照品溶液，-20 ℃下保存备用。

2.1.3 内标溶液 取阿莫西林-d4标准品，直接用溶剂溶解配制成质量浓度为526.6 ?g/mL的内标贮备液，再用溶剂稀释成质量浓度为52.66 ?g/mL的内标溶液，-20 ℃下保存备用。

2.2 样品前处理

精密吸取100 μL血浆，置于1.5 mL离心管中，加入内标溶液5 μL，涡旋混合后加入400 μL乙腈（含0.3%甲酸），涡旋1 min，4 ℃条件下15 000 r/min离心5 min，取上清液进样。

2.3 色谱条件与质谱条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Waters Atlantis dC18（150 mm×2.1 mm，5.0 μm）；流动相A为乙腈溶液（含0.1%甲酸），流动相B为10 mmol/L甲酸铵水溶液（pH 4.5），梯度洗脱（0～1.3 min，99%B；1.3～3 min，99%B→8%B；3～4 min，8%B；4～4.1 min，8%B→99%B；4.1～7 min，99%B）；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为1 μL。

2.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI），以正离子模式、多反应监测（MRM）扫描方式进行定量。离子源电压为5.5 kV，离子源温度为450 ℃，雾化气压力为30 psi，加热气压力为40 psi。阿莫西林离子对为m/z 366.2→113.9，碎裂電压为26 V；内标离子对为m/z 370.2→353.0，碎裂电压为16 V，驻留时间均为200 ms。

2.4 专属性

取6只比格犬，分别取空白血浆各100 μL作为双空白血浆样品；另取空白血浆95 μL，分别加入溶剂5 μL作为单空白血浆样品；再取空白血浆95 μL，加入阿莫西林对照品，制成0.1 μg/mL的含药血浆样品；以给药后1 h的血浆样品作为待测样品，除双空白血浆样品不加入内标外，其余均按“2.2”项下方法处理后，进样检测，记录色谱图，并与阿莫西林+内标溶液的色谱图进行对比。结果显示，阿莫西林与内标的保留时间均为1.72 min左右，双空白血浆样品中内源性物质对于阿莫西林和内标的测定均无干扰，单空白血浆样本中内标对于阿莫西林的测定也无干扰。表明该色谱条件专属性较好。色谱图见图1。

2.5 线性关系与定量下限

取空白血浆95 μL，加入相应浓度的对照品溶液，制备成质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、16 μg/mL的标准曲线样品溶液，按“2.2”项下方法处理后，进样测定，记录峰面积。以阿莫西林与内标峰面积之比为纵坐标（y）、阿莫西林的质量浓度为横坐标（x）进行回归分析，权重为1/x2。得回归方程为y=0.00 035 x-0.000 375（r=0.998 2），阿莫西林的检测质量浓度线性范围为0.1～16 μg/mL，定量下限为0.1 μg/mL。

2.6 精密度与准确度

取空白血浆95 μL，加入相应质量浓度的对照品溶液，制成质量浓度分别为0.1、0.3、2.5、8.0、12.0 μg/mL的质控样品，每个浓度平行配制5份，按“2.2”项下方法处理后，进样测定，记录峰面积，考察批内精密度，并以测得值/真实值×100%计算批内准确度。同法在3 d内配制并测定3批次样品，考察批间精密度和批间准确度。精密度与准确度结果见表1。

2.7 提取回收率

取空白血浆95 μL，加入阿莫西林对照品溶液制成质量浓度分别为0.3、2.5、8.0、12.0 μg/mL的质控样品，加入400 μL乙腈（含0.3%甲酸）后，涡旋1 min，4 ℃条件下15 000 r/min离心5 min，取上清液，加入溶剂5 μL和内标溶液5 μL，涡旋混匀后吸取上清液进样测定，计算阿莫西林与内标峰面积的比值AQC/AIS；另取空白血浆95 μL，加入溶剂5 μL，涡旋混匀后加入400 μL乙腈（含0.3%甲酸），涡旋1 min，4 ℃条件下15 000 r/min离心5 min，取上清液，加入相应质量浓度的阿莫西林对照品溶液和内标溶液制成同上浓度的样品，涡旋混匀后吸取上清液进样分析，计算阿莫西林与内标峰面积的比值AQC/AIS。以（AQC/AIS）/（AQC/AIS）×100%计算提取回收率，每个浓度平行做3份。结果显示，0.3、2.5、8.0、12.0 μg/mL的质控样品的提取回收率分别为63.3%、60.8%、59.3%、58.9%，平均提取回收率为60.6%，RSD为3.3%（n=4）。说明不同质控水平提取回收率变异均较小。

2.8 基质效应

分别取6只比格犬的空白血浆，各95 μL，加入溶剂5 μL，按“2.7”项下方法提取后，再加入0.3、12 ?g/mL质量浓度的对照品溶液5 μL和内标溶液5 μL，涡旋混匀后进样测定，计算阿莫西林与内标峰面积的比值AQC/AIS；以纯化水取代血浆，制备同上浓度的含阿莫西林和内标的纯溶液，进样测定，计算阿莫西林与内标峰面积的比值 AQC/AIS，计算内标归一化基质效应因子（ISMF）=（AQC/AIS）/（AQC/AIS），并计算其RSD。结果显示，在低、高浓度下，不同来源血浆中阿莫西林ISMF的RSD均为2.8%（n=6），符合2015年版《中国药典》的要求。

2.9 稀释效应

配制100 μg/mL的血浆样本，用空白血浆稀释10倍后，按“2.2”项下方法处理后，进样测定，平行测定5份，考察精密度和准确度。结果显示，峰面积的RSD为2.8%（n=5），准确度为107.4%，表明血浆样品经10倍稀释后，不影响其测定结果的准确性。

2.10 稳定性

2.10.1 标准溶液的稳定性 分别将阿莫西林贮备液（2 mg/mL）储存于玻璃容器和塑料容器中，依次在室温、4 ℃、-20 ℃条件下保存48 h、7 d、10 d、14 d，与新鲜配制的贮备液同时进样分析，平行测定3次，考察标准溶液的稳定性。结果表明，阿莫西林室温下稳定性最差， -20 ℃冻存稳定性最好；用塑料容器储存降解速度低于玻璃容器。因此，本研究中标准溶液用塑料容器保存在-20 ℃条件下。样品置于不同容器中的稳定性试验结果见图2。

2.10.2 含药血浆稳定性 分别考察质量浓度分别为0.3、12.0 ?g/mL的含药血浆在室温下放置25 h、-80 ℃反复冻融3次、-80 ℃下放置58 d以及处理后4 ℃下放置120 h的稳定性，平行测定3次，考察准确度和RSD，结果见表2。

2.11 药动学实验

取12只比格犬，♀♂各半，单剂量灌胃阿莫西林胶囊250 mg，分别于给药前（0 h）和给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、8、10 h取前肢静脉血1.0～1.5 mL，分别置于有抗凝剂的离心管中，混匀后3 500 r/min离心10 min，取上层血浆，加入到1.5 mL塑料离心管中，保存于-80 ℃下待测。按本文建立的方法测定血浆样品中阿莫西林的浓度，根据其变化发现阿莫西林在比格犬体内的转运和清除符合一室模型。计算阿莫西林在比格犬体内的药动学参数t1/2为1.56 h，药-时曲线下面积（AUC0-10 h）为24 300 ng·h/mL，cmax为7 523 ng/mL，表观分布容积为0.023 L，清除率为0.010 L/h，tmax为1.5 h。犬体内阿莫西林的药-时曲线见图3。

3 讨论

由于阿莫西林本身化学极性较大且稳定性差，采用液液萃取法进行前处理回收率非常低，因此本研究采用酸性乙腈沉淀蛋白后直接进样，操作简单、快速。由于蛋白沉淀后易存在基质效应影响[5]，本研究采用同位素内标阿莫西林-d4，其理化性质与阿莫西林高度相似，可减小基质效应影响，提高方法的耐用性和检测结果的准确性。此外，由于阿莫西林结构中含有四元环，稳定性较差，因此，本研究对阿莫西林的稳定性及保存条件进行了较为深入的考察，最终选择塑料容器保存标准溶液（-20 ℃）及血浆样本（-80 ℃）。在样本制备和测定过程中，另还需要严格控制pH，以保证检测结果的准确性。

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（收稿日期：2018-06-08 修回日期：2018-10-18）

（编辑：邹丽娟）