基于高效液相色谱法优化测定7种混合单糖的研究*

2018-10-19常青

福建轻纺 2018年10期

常青

（福建农林大学食品科学学院，福建福州，350002）

目前测定单糖的方法主要有高效液相色谱法[1]、气相色谱法[2]、离子色谱法[3]和毛细管电泳法[4]等，其中高效液相色谱法为单糖分析的重要方法之一，因其操作简单，分离效果好，灵敏度高受到广大研究者的青睐。高效液相色谱法测定单糖的方法主要分为衍生法和非衍生法，衍生法又分为PMP柱前衍生法和柱后衍生法。无论是柱前衍生法还是柱后衍生法操作都比较复杂，柱前衍生容易带入杂质，产生误差，柱后衍生法的成本较高。郝桂堂等[5]采用荧光检测法和紫外检测法分析了9种单糖，发现几种单糖的分离度不好。段月等[6]采用柱前衍生法检测枸杞多糖中的单糖组成，虽能有效地分离出几种单糖，但其分离时间长。而非衍生法一般采用示差折光检测器结合糖分析柱进行分析，此法的优点在于无需衍生处理、操作简单和效率高，应用更广泛[7]。欧阳华学等[8]采用示差折光检测法同时检测了枸杞中3种单糖和2种低聚木糖，且加标回收率较高。

因此，本文采用非衍生法，通过示差折光检测器结合糖分析柱将7种不同的混合单糖进行分离，以期为分析多糖中单糖组分提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 试剂

葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、果糖和半乳糖均为色谱纯购自sigma公司，超纯水（实验室超纯水机制备），乙腈（色谱纯）。

1.1.2 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪：美国Waters公司；

Waters 2414示差折光检测器：美国Waters公司；

Q-Gard A2超纯水机：法国Mingche公司；

SHB-III 循环水式多用真空泵：郑州紫拓仪器设备有限公司；

KQ-500VDE型双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器设备有限公司；

津腾聚醚砜（0.45μm）：欧美国家进口膜。

1.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX糖分析柱（Agilent 4.6 mm×250 mm，5μm）；

流动相：不同浓度的乙腈（超声后使用），流速：0.5～1.0 mL/min，柱温：25～35 ℃，检测器温度：30 ℃，进样量10μL。根据前期实验的筛选得到流速在0.8 mL/min、柱温35 ℃时其分离效果最佳，因此共设计4组实验，具体如表1所示。

表1 色谱条件

1.3 标准溶液的配置

分别称取10 mg的葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、果糖和半乳糖用超纯水定容至10 mL，超声后过0.45μm的水相滤膜。取等量过膜后的单糖标准溶液混合作为混合标品。

1.4 定性分析

进行7种混合游离单糖标准品测定时，如果混合标品的出峰时间与单标一致，保留时间偏差在±5%，则可以确定混合标品中各个峰所对应的单糖物质。

1.5 相对保留值的计算

相对保留值是指在一定色谱条件下2个被测组分调整保留时间之比，其计算公式为：

式中：TR(1)——相邻2个峰中第1个峰的调整保留时间；

TR(2)——相邻2个峰中第2个峰的调整保留时间。

1.6 分离度的计算

分离度（R）表示相邻2个色谱峰分离程度的优劣，其计算公式为：

式中：tR(1)——相邻2个峰中第1个峰的保留时间；

tR(2)——相邻2个峰中第2个峰的保留时间；

W1和W2——分别为2峰的峰底宽。

1.7 数据处理

采用Empower 3软件进行相对保留值和分离度的计算，OriginPro 8.5绘制图形，SPSS 13.0处理数据。

2 结果与分析

由图1可知组别1乙腈浓度为75%时的分离效果最差，不能很好的将7种单糖分离开来，因此只对组别2、3、4的相对保留值和分离度进行分析。

图1 7种混合单糖的色谱图

表2 相邻两峰之间的相对保留值

表3 相邻两峰之间的分离度

2.1 相对保留值的计算

相对保留值反应了2个被测组分的分离效果，相对保留值受固定相的种类、柱温以及流动相组成的影响，因此可以通过改变固定相的种类、柱温以及流动相的组成，以达到满意的分离效果[9]。表2是2，3，4组实验结果的相对保留值，由表2可知，流动相乙腈浓度为85%时，核糖和木糖两峰之间、甘露糖和葡萄糖两峰之间的相对保留值显著高于流动相乙腈浓度为83%和80%的相对保留值，说明流动相乙腈浓度为85%时核糖和木糖、甘露糖和葡萄糖其分离效果较好；流动相乙腈浓度为85%时，木糖和阿拉伯糖两峰之间、阿拉伯糖和果糖两峰之间、果糖和甘露糖两峰之间的相对保留值与流动相乙腈浓度为80%的相对保留值无显著差异，但显著高于流动相乙腈浓度为83%的相对保留值；而葡萄糖和半乳糖两峰之间的相对保留值均无显著性差异。因此，当乙腈浓度为85%时，其相对保留值较高，其分离效果较好。

2.2 分离度的计算

表3是2，3，4组实验结果的分离度，由表3可知，流动相乙腈浓度为85%时，木糖和阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖、葡萄糖和半乳糖的分离度显著高于流动相乙腈浓度为83%和80%时的分离度；3种乙腈浓度对核糖和木糖、果糖和甘露糖的分离度无显著影响；而对于阿拉伯糖和果糖，85%和83%的乙腈浓度对其分离度无显著影响，但显著高于乙腈浓度为80%时的分离度。因此当乙腈浓度为85%时，7种混合单糖的分离效果较好。