分离纯化胰岛细胞超薄切片的琼脂预包埋制备方法

首都医科大学（100069）金良韵 姬曼 孙竹林

利用电子显微镜对样品进行观察和研究，不仅要有先进精密的仪器，更要有制备样品所需的各种技术技巧[1]。由于胰岛细胞体积小，分布分散，给电镜取材造成了困难；而在人类胰岛细胞数量庞大，仅占胰腺总体积的1%～2%，如常规电镜取材则费时费力。本研究采用了胶原酶Ⅺ灌注法对小鼠进行取材，避免了取不到胰岛细胞的尴尬。同时采用琼脂预包埋的方法，该方法对样品进行多次离心沉淀不会损伤样品超微结构。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康C57/6J雄性小鼠

1.2 主要仪器设备与试剂 ①超薄切片机（leica UC7）,透射电镜(HITACHI HT7700)。②戊二醛、锇酸、乙醇、丙酮、Epon812、醋酸双氧铀、柠檬酸铅，均购自美国EMS（Electron microscopy science）公司。琼脂糖为美国Sigma公司产品。胶原酶Ⅺ(#C7657)为美国Sigma-Aldrich公司产品。

1.3 方法

1.3.1 分离、纯化胰岛细胞团 将小鼠麻醉，打开腹腔充分暴露十二指肠及周边胰腺，探查胆总管，用动脉夹夹闭靠近十二指肠的乳头处，经胆总管注射2.5mL胶原酶Ⅺ溶液，可见胶原酶沿胰尾顺序充盈，再将其胰尾及其他部分完整摘取，放入50mL离心管中，38℃水浴箱消化10min，加入遇冷HBSS缓冲液至40mL停止消化，1400rpm离心1min，弃掉上清液，重复离心3次。加入4℃ Histopaque1077 7mL重悬，再沿离心管管壁缓慢加入4℃DMEM培养基7mL，可见离心管内液体分液，2000rpm，离心10min。并缓慢吸出两液间的胰岛移至含有6mLHBSS的细胞培养皿（60mm）中。在体式显微镜下，用移液枪挑取完整胰岛，将挑取出来的胰岛放入另一个含有6mLHBSS的细胞培养皿（60mm）中，手动挑取重悬胰岛3次。

1.3.2 戊二醛预固定 在培养皿中加入预冷的4℃戊二醛3～5mL，固定10min，再将液体移至离心管中，离心1500rmp，10min，弃掉上清，重复加入预冷的戊二醛，放入4℃冰箱固定2h。后去掉上清液，加入0.1MPB缓冲液洗3次，每次10min。待后续包埋。

1.3.3 琼脂预包埋 用0.1MPB缓冲液配制琼脂，将其配成2%琼脂溶液，用酒精灯加热至琼脂完全溶解，待琼脂溶液温度降到43℃，仍然保持溶液状态。将胰岛细胞离心（1500rpm，5min），吸出离心管中的PB缓冲液，仅留少量缓冲液浸过胰岛细胞，待琼脂溶液温度降至43℃，向胰岛细胞离心管中快速加入适量液态的2%琼脂溶液，再加入适量PB，迅速离心（1500rpm，3～5min），胰岛细胞呈团状同琼脂块一同沉于离心管底，放入4℃冰箱中凝固。

1.3.4 锇酸后固定 用1%锇酸对其进行后固定，时间以不超过2h为宜。固定后样品组织呈黑色，将带有胰岛细胞的块状琼脂取出，并向其修整为1mm3的小块，再放入试管中继续后续步骤。双蒸水对细胞清洗3次，每次10min。

1.3.5 脱水、置换、渗透及包埋 分别对其进行50%、70%、90%、100%酒精脱水，每次10min；环氧丙烷置换2次，每次15min；Epon812树脂低纯度（1∶1）渗透40min室温，中纯度（1∶3）渗透40min室温，纯树脂渗透40min室温。包埋聚合35℃5h，60℃5h，70℃9h。

1.3.6 超薄切片 将聚合完成的树脂块在leica UC7徕卡切片机上切成70nm厚度的超薄切片。捞至100目的铜网，待红外线烘干后，醋酸双氧铀染色20min，柠檬酸铅染色2min，蒸馏水冲洗后于透射电镜(HITACHI HT7700)下观察。

2 结果

超薄电镜下（透射电镜HT7700）观察胰岛细胞，核为圆形，核膜清晰完整，核周间隙正常，胞质内可见结构清晰的线粒体、核糖体、粗面内质网等细胞器，另可见较多的内分泌颗粒，多数为胰岛B细胞的分泌颗粒，内部为胰岛素，少数为其他类型的内分泌颗粒，均获得结构清晰完整的胰岛细胞。

附图1、附图2 小鼠胰腺细胞。可见细胞膜界限清晰、细胞核完整、胞浆内见大量内分泌颗粒。透射电镜×2000倍、×2500倍。

附图3、附图4 小鼠胰腺细胞。细胞膜结构清晰、可见细胞膜间连接，胞浆内见大量内分泌颗粒和线粒体。透射电镜×3000倍、×4000倍。

3 讨论

要想获得最终完美的电镜图像，每一个步骤都会是其影响因素，因此在制作过程中不能放过任何一个细节。本实验的取材采取了胶原酶Ⅺ灌注法，并用琼脂预包埋的方法，成功地得到了小鼠胰岛细胞的透射电镜样品，获得了良好的超微结构。张旭东等[2]利用直接取材法也成功得到了胰岛细胞的超薄切片，但本实验方法的优点在于：①制成树脂包埋块以后无需半薄定位，直接超薄切片，避免反复定位，更快速，省去时间成本。②直接取材的方法，经常定位不准确，取不到有效区域，则需要重新取样，反而费时费力。而本实验可以做到精准取材，高速有效，能够在有限的观察视野下，看到更多的胰岛细胞。而后利用琼脂预包埋法，把相对松散又细小的胰岛细胞集中在一起，更加提高了超薄切片上的有效区域，有利于实验人员更为全面地观察和判断胰岛细胞的超微结构。本实验的关键不是琼脂的浓度，而是琼脂低熔点的特性，在高温煮沸琼脂后将温度降至40℃时，琼脂仍然为液体状态，加入后与胰岛细胞混合，离心，待温度降到40℃以下时则琼脂凝固，此时胰岛细胞已经离心、团聚至琼脂最下方。此外，琼脂的低熔点也避免了细胞内超微结构受损。除了琼脂低熔点的特性以外，胶原酶Ⅺ的浓度和时间也是决定获取胰岛细胞多与少的关键因素：如若浓度过低或时间过短，会使胰岛尚未完全分离，而外分泌腺则会混入其中；若浓度过高或时间过长，则会破坏胰岛包膜，消化过度。

本实验方法中需要注意的细节有：①锇酸进行后固定以后，带有琼脂的胰岛细胞会显色，被氧化成黑色，需要修掉多余的琼脂块，最后留少量琼脂，以便后续的脱水和渗透。如果琼脂浓度过高也不利于脱水和渗透。②将琼脂加入到胰岛细胞时的温度：温度过高容易烫损细胞，温度过低容易使琼脂凝固，无法离心沉淀。

综上所述，本实验通过胶原酶Ⅺ灌注的方法取材，后经利用低熔点琼脂预包埋，成功制备出胰岛细胞的超薄切片，可有效获得数量较多的并且超微结构不受损伤的胰岛细胞结构。在利用胶原酶Ⅺ灌注取材的时候会相对比直接取材相对更费事，但是这种方法可以在制样后段有效地提高工作效率，并对胰岛调节血糖的机制提供了可靠而有效的方法。